斑马鱼已经成为最受重视的脊椎动物发育生物学模式之一,但斑马鱼体内的基因打靶技术尚不成熟,不利于对斑马鱼基因的生物学功能进行深入研究。2008年国际上发展出一种新的斑马鱼基因敲除技术,即锌指核酸酶寡聚体库工程(Oligomerized pool engineering)进行基因敲除,简称OPEN法基因打靶技术。本文探索利用OPEN法基因打靶技术敲除斑马鱼POP3基因,以便进一步建立斑马鱼POP3基因敲除品系。本文通过ensembl信息库(http://www.ensembl.org/)查找到斑马鱼基因POP3基因位置,获得该基因外显子、内含子及开放阅读框信息,将POP3编码序列输入到ZiFiT软件中,通过“锌指核酸酶”资源库分析序列所有潜在的锌指蛋白靶位点,从中选择最合适的锌指蛋白靶位点。针对每个半位点,首先从文库中扩增出了单锌指蛋白(ZFP),再通过PCR技术将三个单锌指蛋白编码序列有序的聚合在一起,构建包含所有组合的三联体锌指编码序列的大肠杆菌文库。利用OPEN技术,针对每个半位点筛选出活性较强的6个锌指蛋白序列,通过细菌双杂交(B2H)方法检测这些锌指蛋白对靶位点的特异结合能力较强。分析结果表明,本文已成功筛选出靶位点355bp处的2个半位点锌指蛋白,该锌指蛋白可作为斑马鱼体内基因打靶工具。另一方面,本文还用荧光报告系统分析了POP3与ATF4相互作用关系,以及二者在心脏发育中调控GATA4的情况。该研究是基于POP3基因的前期有关研究结果而进行的。前期实验表明POP3与ATF4存在相互作用。本文通过生物信息学分析GATA4启动子序列,发现人类GATA4转录起始位点上游-2000bp左右有一个保守的CRE类似位点。通过克隆技术获得了人类基因GATA4启动子序列质粒,利用荧光系统分析发现GATA4启动子上的CRE序列至关重要,POP3与ATF4通过GATA4启动子上的CRE序列激活GATA4的转录活性,从而在报告系统分析水平上证明POP3与ATF4相互作用,通过特异结合在GATA4启动子上的CRE转录位点来调控GATA4的表达。