目的:　　 1.了解温州地区念珠菌的临床感染及耐药情况,为临床抗真菌药物选择提供依据。　　 2.研究念珠菌对唑类药物的耐药机制,分析其与抗菌药物敏感性的关系,为预防和治疗念珠菌感染提供依据。　　 方法:　　 1.菌株来源:2007年1月至2007年12月从温州医学院附属第一医院各科住院患者送检的痰、尿、粪便、脓液、血液等标本中分离的非重复念珠菌410株,其中来源于痰液243株,尿液117株,粪便22株,脓液22株,血液8株,其他部位9株。药敏试验质控菌株为白念珠菌ATCC90028。　　 2.耐药性检测:选取62株分离鉴定好的菌株进行氟康唑(FLC)、伊曲康唑(ITC)、两性霉素B(AMB)、酮康唑(KTC)的E-test药物敏感试验。包括白念珠菌18株(非痰液标本)、光滑念珠菌19株、热带念珠菌16株、克柔念珠菌4株和近平滑念珠菌5株。　　 3.耐药基因突变检测:取上述药敏试验的白念珠菌18株,提取其基因组DNA,通过PCR技术扩增.ERG11基因全序列,并进行测序,以检测其突变情况,应用CodonCode软件对已测序的.ERG11基因序列进行比对分析,对所得到的氨基酸序列,通过计算机模拟来预测其三维结构,应用SPDBV4.01和raswin软件来分析其空间结构的差异。　　 4.外排泵基因表达量检测:取上述药敏试验的白念珠菌18株,提取其RNA,通过RT-PCR技术扩增CDR1、CDR2和MDR的mRNA,通过与内参基因TEF3的灰度值比较,来评价CDR1、CDR2和MDR的mRNA表达量改变情况。　　 结果:　　 1.菌种分布:410株念珠菌中,以痰标本所占的比例最高占59.2％,其他依次是尿液28.5％、粪便5.4％、脓液2.7％、血液2.0％、其他来源的标本2.2％;菌种分布以白念珠菌为主占57.8％,其次为光滑念珠菌22.4％和热带念珠菌14.9％,克柔念珠菌2.7％,近平滑念珠菌1.0％,其他念珠菌1.2％。除白念珠菌占首位外,其他菌种在不同来源标本中的分布比例存在差异,光滑念珠菌在痰液中分布最多,占59.8％,其次为尿液,占33.7％;热带念珠菌则在尿液中分布最多,占57.4％,其次为痰液,占37.7％。　　 2.耐药情况:根据临床实验室标准化研究所(CLSI)公布的致病性酵母菌抗真菌药敏试验方案M27-A对FLC和ITC最低抑菌浓度(MIC)折点的规定,本研究发现FLC对近平滑念珠菌的敏感性最好,敏感率为100％;其次为热带念珠菌,敏感率为93.8％;白念珠菌和光滑念珠菌的敏感率为66.7％;对克柔念珠菌50％药物依赖敏感,50％耐药。ITC对近平滑念珠菌的敏感性也最好,均敏感;其次为白念珠菌,敏感率为66.7％;对热带念珠菌的敏感率为62.4％;对克柔念珠菌的敏感率为25％,对光滑念珠菌全耐药。　　 3.耐药基因突变检测:对18株白念珠菌,按照氟康唑类药物敏感情况进行分组,评价其ERG11基因突变情况。结果显示,无论是敏感菌株还是耐药菌株均存在着两种错义突变,包括495T＞A(D116E,天冬氨酸转变成谷氨酸)和945A＞C(E266D,谷氨酸转变成天冬氨酸)。其中单纯性D116E突变占到所有菌株的27.8％(5/18),单纯性E266D突变占到所有菌株的50.0％(9/18)。比较了几种突变类型和耐药发生的关系,结果显示单纯性E266D突变通过Fisher's确切概率法计算,虽然P值为0.131(检验水准为α=0.05),但是OR值却高达10.0(95％CI:0.86-117.0),三维晶体结构预测显示E266D突变可引起ERG11结构上轻微改变。　　 4.外排泵基因表达量检测:通过与内参基因TEF3的灰度值比较,未发现耐药菌株CDR1和CDR2的mRNA表达量增加,但发现MDR的mRNA表达量增加。　　 结论:　　 1.临床上念珠菌感染中仍以白念珠菌为主,检出率超过50％,但比例有所下降;而非白念珠菌尤其是光滑念珠菌、热带念珠菌的检出率大大增加,尤其是光滑念珠菌超过热带念珠菌居第二位,这可能是因为唑类抗真菌药物的大量使用,使得白念珠菌、热带念珠菌的感染得到一定控制,而耐唑类药物的光滑念珠菌的发生率升高,应引起临床的高度重视。　　 2.抗真菌药物对念珠菌的抑菌效果具有明显的种间差异。四种抗真菌药物对近平滑念珠菌的体外抗菌活性最好,药敏试验中的MIC值均很低;对热带念珠菌的体外抗菌活性总体较好,但出现了对FLC、ITC的耐药株。FLC和ITC对光滑念珠菌和克柔念珠菌的耐药性均很高,与唑类药物对这两种念珠菌可能存在天然耐药现象有关;对白念珠菌的耐药性也较高,可能与临床上大量、长期使用FLC导致耐药株的过早产生有关;AMB和KTC对大多数念珠菌的体外抗菌活性菌较强。耐药株中存在对FLC和ITC的交叉耐药现象。　　 3.本研究观察到无论是敏感菌株还是耐药菌株均存在着ERG11基因495T＞A和945A＞C的突变,提示这些突变可能仅仅是种多态性变异。配对观察这些突变类型和耐药发生的关系,显示单纯性E266D突变具有较高的OR值(10.0)和95％CI值(0.86-117.0),说明携带有E266D突变株较未携带有该突变的菌株发生对氟康唑类药物耐药的几率高10倍。提示E266D可能是白念珠菌对氟康唑类药物耐药的重要原因之一。　　 4.对多种外排基因的mRNA表达量进行检测,发现MDR基因mRNA表达量在耐氟康唑的菌株中明显上调,提示MDR基因可能也参与了白念珠菌的耐药机制。　　 5.念珠菌对唑类药物高度耐药通常是多种耐药机制共同作用的结果。包括靶酶编码基因的突变和/或过度表达,膜外排泵基因表达增加等。这些耐药机制不是相互孤立存在的,他们所产生的协同作用使念珠菌产生了对抗真菌药的耐药性。