论文部分内容阅读
嗜线虫致病杆菌HB310菌株(Xenorhabdus nematophila HB310，Xn HB310)是本实验室从小卷蛾斯氏线虫中分离得到的一种具有广谱杀虫和抑菌活性的昆虫病原线虫共生细菌。本研究利用非变性凝胶电泳native-PAGE切胶回收方法从Xn HB310胞内总蛋白中通分离得到了一种对大蜡螟具有血腔注射活性的PirB蛋白，经室内测定该蛋白对5龄大蜡螟幼虫血腔注射毒力LD50为13.92ng/头。 在X.nematophila基因组序列的pirB基因附近我们也发现了pirA基因，为了深入的了解pirB基因的特性以及它和pirA基因之间的关系，我们根据质谱鉴定结果和GenBank上已登录的X.nematophila ATCC19061基因组信息设计引物克隆了XnHB310中pirA和pirB基因，分别构建了克隆载体pMD18-T-pirA和pMD18-T-pirB，通过基因测序获得pirA和pirB全长基因序列。对测序得到基因序列进行生物信息学分析显示，pirA基因完整开放阅读框全长408bp，编码135个氨基酸，PirA蛋白理论分子量为14.9kDa，等电点为5.0，为水溶性蛋白，该蛋白不含信号肽和跨膜结构域，PirA蛋白有82.6％的概率定位于细胞核;pirB基因完整开放阅读框全长1290bp，编码429个氨基酸，蛋白质理论分子量为48.2kDa，等电点为5.0，为水溶性蛋白，该蛋白存在跨膜结构，但是不含信号肽，含有类似Bt Endotoxin内毒素结构域和Jacalin_like凝集素结构域，PirB蛋白有69.6％的概率定位于细胞核，21.7％的概率定位于线粒体，8.7％的概率定位于细胞质。二级结构预测显示PirA蛋白不含有α螺旋，含有12个β折叠;PirB蛋白含有8个α螺旋和12个β折叠。最后通过同源建模在线软件构建了PirA和PirB蛋白的三级结构模型。 为明确PirA和PirB蛋白的生物活性以及这两个蛋白之间的关系，分别构建了pET28a-pirA和pET28a-pirB原核表达载体，并且将pirA和pirB基因通过柔性接头(GSGSGSGS)连在一起构建了pET28a-pirAB原核表达载体，转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，经IPTG诱导表达得到了17kDa的重组蛋白PirA、48 kDa的重组蛋白PirB和64 kDa的重组融合蛋白PirAB-fusion。利用亲和层析技术对表达的三种重组蛋白进行了纯化，将纯化的重组蛋白对5龄大蜡螟进行血腔活性测定，结果表明单独表达的重组PirA和PirB蛋白以及PirAB-fusion蛋白对大蜡螟都没有血腔杀虫活性，但是PirA+PirB蛋白（PirA和PirB蛋白1∶1的混合物）表现出明显的血腔杀虫活性，对5龄大蜡螟幼虫的LD50为2.718μg/头。该结果证明来自嗜线虫致病杆菌的PirA和PirB是二元毒素。