研究背景乳源性的?-酪蛋白(β-CN)含有丰富的生物活性肽,这些生物活性肽在体内发挥着各式各样的生理功能,因此,?-酪蛋白被誉为乳蛋白中的战略活性蛋白。制备和提取?-酪蛋白为研究?-酪蛋白及其中包含的生物活性肽具有重要的意义,也为开发乳品奠定一定基础。传统方法获得?-酪蛋白主要是从乳中分离纯化,但获得的?-酪蛋白产量较低,且分离纯化难度较大,为?-酪蛋白的研究和开发带来不便。随着生物技术飞速发展,利用基因工程手段直接获得?-酪蛋白为人们提供了新的思路和方法。各种哺乳动物和人?-酪蛋白高度保守,尤其小鼠?-酪蛋白与人的?-酪蛋白又有很高的同源性,本研究以小鼠?-酪蛋白作为研究对象。目的构建小鼠?-酪蛋白基因重组体,在大肠杆菌内诱导其表达,纯化?-酪蛋白并研究其酶解液的部分功能。方法从哺乳期小鼠乳腺组织提取总RNA,通过RT-PCR获得?-酪蛋白基因编码序列,再与融合蛋白表达载体pGEX-KG连接,构建原核表达质粒pGEX-KG-β-CN,将其转化到E.coli DH5α宿主内,在20℃,用低浓度的IPTG进行长时间的诱导,超声破碎细菌后SDS-PAGE分析。利用?-酪蛋白基因重组体表达的融合蛋白氨基端带有GST标签,用商品化的GST beads(Glutathione Sepharose 4B),亲和层析的方法纯化β-CN融合蛋白。以纯化的β-CN融合蛋白为底物,用胰蛋白酶、糜蛋白酶作用底物60min、90min、120min、150min,得到不同时间段的酶解液。通过体内和体外两系列实验,观察了β-CN融合蛋白酶解液对大鼠和小鼠淋巴细胞转化的影响。结果经限制内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实所构建的质粒pGEX-KG-β-CN,SDS-PAGE证实诱导表达后所获得的融合蛋白分子量为52KD,表达量占菌体蛋白的12.4%且主要存在于上清液中。纯化后产物经胰蛋白酶、糜蛋白酶作用90min、120min,其对大鼠和小鼠淋巴细胞转化有明显的促进作用。结论成功构建重组表达质粒pGEX-KG-β-CN,并在大肠杆菌中获得了可溶性表达。成功纯化了融合蛋白,其酶解液对大鼠和小鼠体内外淋巴细胞转化有促进作用。