自噬在甲基苯丙胺引起海马神经元凋亡中的作用及机制研究

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第一部分自噬对甲基苯丙胺引起海马神经元凋亡的影响甲基苯丙胺(Methamphetamine,Meth)是一种新型、易成瘾的精神兴奋药物,主要影响单胺类神经递质的转运系统,导致神经系统兴奋性毒性和能量稳态失衡,滥用者可出现严重的神经损伤。近年来,甲基苯丙胺滥用者数量增长极快,已经成为一个备受关注的公共卫生问题。Meth引起细胞凋亡进而导致中枢神经系统发生退行性改变。故本实验立足Meth引起的神经元凋亡这一现象,探讨Meth引起的神经退行性病变样改变的机制。研究结果显示,Meth可引起c-caspase 3,c-PARP凋亡蛋白水平增加,且呈时间和剂量依赖性,bcl-2则呈时间和剂量依赖性的减少。自噬是一种进化上高度保守的代谢机制,可将细胞组分通过溶酶体中的多种酶进行消化和循环利用。该研究显示,Meth作用神经元细胞后,自噬标志性蛋白Beclin1,ATG5,Lc3-Ⅱ/Lc3-Ⅰ呈时间和剂量依赖性的增加,p62上调。免疫荧光实验亦发现,Meth暴露后Lc3的荧光强度显著增强。此外,我们发现作为调节自噬过程的重要通路,mTOR/p70S6K在Meth处理海马神经元24h后,与对照组相比,p-p70S6k、p-mTOR蛋白表达水平显著下降。为探讨自噬在Meth引起海马神经元凋亡中的作用,本实验应用自噬特异性激动剂雷帕霉素和抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)处理细胞,进而检测凋亡相关蛋白的表达水平。结果显示:与Meth处理组相比,雷帕霉素+Meth处理组的 c-caspase 3,c-PARP 的表达降低,3-MA+Meth 处理组的 c-caspase 3,c-PARP的表达升高,bcl-2的表达差异未发现有统计学意义,上述结果提示,自噬在Meth引起的神经元损伤过程中可能发挥重要作用。第二部分甲基苯丙胺对溶酶体数目、功能和LAMP1的影响溶酶体是膜结构的细胞器,存在于所有的真核细胞。溶酶体被称为自噬终端处理站,可有效清除细胞代谢物及损伤的大分子蛋白甚至细胞器,维持必要的生物合成反应。基于第一部分Meth处理后,自噬活动的增强,我们进一步观察了神经元Meth处理后,溶酶体可能发生的结构或功能性的改变。利用多种荧光探针,我们分别检测了溶酶体的数量,pH及溶酶体中关键酶组织蛋白酶活性的改变。结果显示:与对照组比较,Meth处理组后多种荧光强度均明显强于对照组,提示Meth作用后,溶酶体的数量增多,pH值下降,组织蛋白酶活性上升。进一步通过western blot法验证,发现Meth处理组溶酶体标志性膜蛋白LAMP1的水平显著升高。上述溶酶体的数量、pH、组织蛋白酶活性的改变提示Meth对自噬下游过程亦具有重要的调节作用。第三部分自噬体与溶酶体融合障碍加重甲基苯丙胺对神经元的凋亡自噬体与溶酶体的融合在整个自噬流中的作用十分重要,该过程是将自噬体包裹的细胞代谢物呈递给溶酶体,继而进行降解和循环利用,也是自噬体和溶酶体形成自噬溶酶体的过程。本实验采用了自噬双标腺病毒感染原代海马神经元,结果显示:与对照组和雷帕霉素处理组相比,叠加之后Meth处理组红色斑点减少,黄色斑点与红色斑点之比升高,Meth阻碍自噬体与溶酶体融合。为检测自噬体和溶酶体融合障碍是否影响Meth引起的神经元凋亡,利用自噬体与溶酶体融合阻滞剂氯喹(Chloroquine,CQ)和巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1,bafA1),观察Meth处理海马神经元后细胞凋亡相关蛋白的表达。结果显示:与Meth处理组相比,氯喹+Meth处理组和bafA1+Meth处理组的c-caspase 3表达上升,bafA1+Meth处理组c-PARP的表达上升,差异具有统计学意义,而bcl-2、bax未发现统计学差异的改变。
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