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目的:通过对山东省淄博市淄川区两个不同生境主要蚊媒种群及密度构成、携带病毒以及杀虫剂抗药性相关基因多态性现况调查,了解当地蚊媒种群密度季节消长趋势、蚊媒携带病毒种类及带毒率现况,从基因水平检测分析抗性基因多态性,为当地媒介控制提供基础数据。方法:1 针对淄川区南高北低的地形特征,分别在丘陵及平原两种地形各抽样选取一处调查点进行蚊媒样本调查。平原地区选择罗村镇作为调查点,丘陵地区选择太河镇作为调查点,两调查点间直线距离为15.8公里。自2017年8月—2018年7月,在蚊媒活动高峰期,按照《全国病媒生物监测方案》,使用诱蚊灯法采集蚊媒样本,进行蚊媒种群和密度调查,监测期间每月上下旬各开展一次蚊虫密度监测,两次间隔15 d以上,每次每点布放2盏诱蚊灯,采集时间为日落后1小时至日出。蚊虫采集后,样本置于冰上快速完成鉴定,成蚊形态鉴定方法参照《中国重要医学昆虫分类与鉴别》。保留雌蚊,记录蚊媒种类、采样时间、采样地点、诱蚊灯编号等信息,样本分装冻存。使用Excel软件进行数据汇总统计分析,统计两调查点各调查时间蚊虫种群密度及构成。2 在采集的蚊虫样本中,选取淡色库蚊(Culex pipiens pallens)进行蚊虫病毒携带种类检测及带毒率计算。使用高通量全自动核酸纯化系统(MagNAPure 96 System)提取淡色库蚊RNA,通过RT-PCR扩增技术,对蚊虫进行甲病毒属(Alphacirus)病毒、黄病毒属(Flavivirus)病毒、布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)病毒和辽宁病毒(Liaoning virus,LNV)目标片段扩增及测序,检测蚊虫所携带的病毒种类及数量,对获得的PCR阳性产物送生物技术公司进行克隆测序,根据测序结果判定样本是否携带病毒。利用MEGA7.0软件对所得病毒RNA非结构蛋白基因(non-structural proteins gene)NS5基因和编码结构蛋白(encode structural proteins gene)E基因核酸序列与Genbank中已知库蚊黄病毒(Culex Flavivirus,CxFV)参考毒株进行系统发生树构建系统分析及遗传距离计算,分析确定病毒的基因型。利用Excel软件PooledInfRate v4统计程序通过最大似然法估计蚊虫带毒率。3从采集的淡色库蚊样本中,按照蚊虫采样时间及地点进行分层抽样抽取采样管35管,抽取的采样管每管再随机抽取1只淡色库蚊,使用高通量全自动核酸纯化系统提取淡色库蚊DNA,通过PCR技术扩增淡色库蚊钠离子通道击倒抗性(knockdown resistance,kdr)基因片段,将PCR阳性产物送生物技术公司进行克隆测序,检测kdr等位基因序列。通过Bioedit软件对PCR产物测序序列进行比对分析,确定kdr相关钠通道基因突变位点基因突变类型,计算突变频率。使用IBM SPSS Statistics 25软件对淄川区两调查采样点蚊虫kdr基因突变频率进行统计分析,率的比较采用X2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1在淄川区共捕获雌性成蚊830只,包括淡色库蚊690只、骚扰阿蚊(Armigeres subalbatus)114 只、白纹伊蚊(Aedes albopictus)21 只、刺扰伊蚊(Ae.vexans)2只、中华按蚊(Anophelessinensis)2只和三带喙库蚊(Cx.tritaeniorhchus)1只。其中淡色库蚊为当地优势蚊种。淄川区蚊虫种群密度为14.82只/(台·夜),全年蚊虫密度监测曲线呈双峰趋势,高峰出现在6月和9月,7月出现暂时性下降趋势。刺扰伊蚊为首次在当地发现,为新记录种类。罗村镇、太河镇两地淡色库蚊种群密度季节消长趋势均呈双峰趋势,罗村镇蚊密度高峰出现较太河镇早。罗村镇蚊虫种类比太河镇多。淡色库蚊占淄川区采集蚊虫总数的83.13%,种群密度为12.32只/(台·夜),全年密度监测曲线亦呈双峰趋势,高峰同样出现在6月和9月。2 本研究共采集到690只淡色库蚊分33组,对其进行病原携带情况检测。从其中3组淡色库蚊中扩增得到蚊虫黄病毒(Insect-specific Flavivirus,ISFVs),阳性检出率为9.09%,蚊媒活动高峰期蚊虫带毒率为5.04‰(95%CI:1.35‰—13.78‰);未检测到甲病毒属病毒、布尼亚病毒属病毒和辽宁病毒。3组淡色库蚊均通过NS5基因及E基因特异性引物分别扩增得到特异性条带。系统发育分析发现NS5基因3组病毒遗传距离均小于0.008,与分离自上海的库蚊黄病毒毒株(MG602497.1)遗传关系最近,相似度为96.83%—97.23%;E基因3组病毒遗传距离均小于0.002,与分离自日本东京的库蚊黄病毒毒株(AB262759.2、AB377213.1)遗传关系最近,相似度为97.55%—97.72%。经分析3组病毒为库蚊黄病毒(Culex Flavivirus,CxFV),并推测核酸分型为I型。将三株库蚊黄病毒序列分别上传至GenBank数据库中,获得NS5基因序列的GenBank收录号分别为MK422516、MK422517、MK422518,E基因序列的GenBank收录号分别为MK609521、MK609522、MK609523。3 本研究抽样检测35只淡色库蚊钠离子通道kdr基因的变化,其中罗村镇的样本抽样检测19只,太河镇的样本抽样检测16只。在kdr基因1014位点发现5种kdr等位基因类型,包括TTA(75.71%)、TTT(10.00%)、CTA(5.71%)、TCA(4.29%)、TTC(4.29%),同时发现2种核苷酸非同义突变,即亮氨酸(L1014)突变为苯丙氨酸(L1014F)、丝氨酸(L1014S)。淄川区共检测得到7种kdr基因型,其中罗村镇淡色库蚊种群中kdr基因包括4种基因型:L1014/L1014(TTA/TTA)、L1014F/L1014(TTT/TTA)、、L1014L/L1014S(TTA/TCA)、、L1014S/L1014(TCA/TTA),太河镇淡色库蚊种群中kdr基因包括6种基因型:L1014/L1014(CTA/CTA)、L1014F/L1014F(TTT/TTT)、、L1014S/L1014F(TCA/TTC)、、L1014/L1014(TTA/TTA)、、L1014F/L1014(TTT/TTA)、L1014S/L1014(TCA/TTA)。在太河镇淡色库蚊基因中首次检测发现kdr基因CTA、TTC突变类型。罗村镇、太河镇两地淡色库蚊kdr基因突变频率分别为10.53%、40.63%,差异具有统计学意义(x2=8.559,P=0.003)。淄川区淡色库蚊kdr等位基因突变频率为24.29%(17/70),kdr基因型突变频率为37.14%(13/35)。结论:淄川区共采集得到淡色库蚊、骚扰阿蚊、白纹伊蚊、刺扰伊蚊、中华按蚊、三带喙库蚊6种蚊虫,其中淡色库蚊为当地优势蚊种,刺扰伊蚊为首次在当地发现,为新记录种类。淄川区蚊虫密度季节消长趋势曲线为双峰趋势,罗村镇淡色库蚊密度高峰出现较早,且蚊虫种类比太河镇丰富。检测发现淄川区淡色库蚊携带库蚊黄病毒,未检测发现携带其他虫媒病毒。本研究在淡色库蚊中检测发现与抗药性相关的钠离子通道kdr等位基因突变,并首次在淡色库蚊中检测发现CTA、TTC两种kdr等位基因突变,kdr基因型在淄川区蚊虫中呈多态性。