研究背景及目的:在中国,食管癌在肿瘤致死率及恶性疾病中分别占第六位和第八位。尽管食管癌的诊断技术和治疗方法不断提高,但食管癌患者预后仍然很差,5年生存率只有17%,主要因为食管癌早期症状不明显,大多数患者确诊已是晚期阶段。在中国,食管癌的主要病理类型是食管鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC)。目前,导致食管癌的细胞及分子机制还未被详细阐述,因此找到它的分子治疗靶点非常重要。Maelstrom(MAEL)基因最初在果蝇的染色体上发现,对精子形成、减数分裂及Piwi介导的转座子沉默发挥重要作用。在人体正常组织中,MAEL只表达在男性的睾丸生殖细胞中;后来的研究发现它在很多类型的肿瘤细胞中存在异常表达的现象,而且有研究证实MAEL是一种新型的癌睾抗原,能够受甲基化调控。目前,MAEL在人肝癌、膀胱癌和结直肠癌的1q24位置被发现,能够促进肿瘤细胞的侵袭、迁移及转移,与患者生存期密切相关。因此,MAEL作为免疫治疗的靶点有很多的优势。目前,MAEL在食管鳞癌中的表达、功能及相关机制还未被研究。肿瘤微环境除了肿瘤细胞在此栖息之外,还有多种免疫抑制因子和免疫抑制细胞,它们能够影响肿瘤的进展。趋化因子IL-8(interleukin-8)在肿瘤微环境中是一种比较重要的免疫抑制因子,通过与MDSCs上的受体CXCR1/CXCR2结合招募髄源性抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)到肿瘤部位。MDSCs是肿瘤微环境中一种重要的免疫抑制细胞,能够分泌多种免疫抑制因子,促进肿瘤进展。本文旨在研究MAEL在食管鳞癌中的表达及功能,并分析它与患者临床病理参数及预后的相关性,进一步探讨MAEL在食管鳞癌进展中所涉及到的相关机制。第一部分Maelstrom在食管鳞癌患者中的表达及功能分析方法1)qRT-PCR方法检测MAEL在食管鳞癌及对应的癌旁正常组织的表达。2)分析MAEL表达与食管鳞癌患者临床病理参数之间的相关性。3)免疫组化检测MAEL蛋白在食管鳞癌及对应的癌旁正常组织的表达。4)分析MAEL表达与食管鳞癌患者预后的相关性。5)qRT-PCR检测MAEL在食管永生化细胞系及多种食管癌细胞系中的表达。6)应用逆转录病毒介导的MAEL过表达和敲低的载体分别转染TE7和TE1细胞,qRT-PCR和Western blot检测MAEL的表达。7)CCK8检测过表达或敲低MAEL对食管癌细胞增殖的影响。8)低粘附板观察MAEL过表达或敲低对食管癌细胞成球能力的影响。9)qRT-PCR检测MAEL过表达或敲低对食管癌细胞干性的影响。10)建立裸鼠移植瘤模型,观察过表达或敲低MAEL对裸鼠移植瘤生长的影响。结果1)MAEL m RNA在食管鳞癌组织的表达显著高于对应的癌旁组织,P<0.05。2)MAEL m RNA的表达与患者淋巴结转移、临床分期及分化程度相关,P<0.05。3)食管癌组织MAEL蛋白的表达高于对应的癌旁组织。4)MAEL高表达组患者的无疾病生存率和总生存率低于MAEL低表达组,P<0.05。5)应用的细胞系均能检测到MAEL m RNA的表达,其中在TE7中表达最低,在TE1中表达最高,P<0.05。6)qRT-PCR和Western blot检测MAEL过表达或敲低的效率,即MAEL在m RNA及蛋白水平表达明显升高或降低,P<0.05。7)过表达或敲低MAEL,食管癌细胞的增殖能力明显升高或降低,P<0.05。8)MAEL过表达或敲低,促进或抑制食管癌细胞的成球能力,P<0.05。9)过表达或敲低MAEL,干性基因CD133、OCT4、Nanog及Notch1的表达明显升高或降低,P<0.05。10)在裸鼠移植瘤模型中,过表达或敲低MAEL,裸鼠肿瘤的形成能力、肿瘤体积和质量升高或降低,P<0.05。小结1)食管癌组织中MAEL的表达高于癌旁正常组织,且与患者的临床病理参数及生存期相关,MAEL可能是食管癌患者预后的一个指标。2)MAEL过表达或敲低,食管癌细胞的增殖、自我更新能力及干性明显升高或降低,提示MAEL在食管癌的恶性行为中发挥重要作用。3)MAEL过表达或敲低,在裸鼠模型中发挥促进或抑制肿瘤的形成和发展的作用。第二部分Maelstrom通过调控Akt1/Rel A/IL-8信号通路招募MDSCs方法1)多因子检测试剂盒、qRT-PCR及Elisa试剂盒检测过表达或敲低MAEL对IL-8表达的影响。2)qRT-PCR检测IL-8在食管鳞癌组织及癌旁正常组织中的表达,并分析与MAEL的相关性。3)免疫组化检测IL-8在食管鳞癌组织及对应的癌旁正常组织中的表达。4)分析IL-8蛋白与食管鳞癌患者预后的相关性。5)流式细胞术检测磁珠分选后的MDSCs的纯度6)Transwell检测过表达或敲低MAEL,IL-8对MDSCs的招募,以及IL-8中和抗体处理后对MDSCs招募的影响。7)建立裸鼠移植瘤模型,在MAEL敲低的体系中,观察IL-8对MDSCs招募的影响。8)Western blot和qRT-PCR检测过表达或敲低MAEL以及用PI3k、Akt1及Rel A抑制剂处理后,Akt1、Rel A及IL-8蛋白表达的改变。9)MDSCs上清与食管癌细胞共孵育,qRT-PCR检测MAEL、干性基因及EMT基因的表达。10)Elisa试剂盒检测MDSCs上清中细胞因子的表达。11)qRT-PCR检测TGF-β、IL-6及IL-10分别处理肿瘤细胞TE7后,MAEL、干性基因及EMT基因的表达。12)Western blot检测TGF-β和(或)TGF-β抑制剂处理过的细胞中,MAEL、Smad2及Smad3的表达。结果1)过表达或敲低MAEL,IL-8的表达相应的升高或降低,P<0.05。2)在m RNA水平上,IL-8在癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织,并且与MAEL成正相关,P<0.05。3)食管鳞癌组织IL-8蛋白的表达高于对应的癌旁组织,P<0.05。4)IL-8蛋白高表达组患者的无疾病生存率和总生存率低于IL-8低表达组,P<0.05。5)磁珠分选后,MDSCs的纯度高于90%。6)过表达或敲低MAEL,IL-8对MDSCs的招募能力升高或下降,且IL-8中和抗体处理后对MDSCs的招募能力下降,P<0.05。7)在裸鼠移植瘤模型中,MAEL敲低或应用IL-8中和抗体处理细胞后,对MDSCs的招募能力下降,P<0.05。8)过表达或敲低MAEL,p Akt1、p Rel A及IL-8蛋白和m RNA表达升高或降低,P<0.05;PI3k、Akt1及Rel A抑制剂处理后,p Akt1、p Rel A及IL-8蛋白和m RNA表达降低,P<0.05。9)MDSCs上清与肿瘤细胞共孵育后,MAEL、CD133、Nanog、Notch1、β-catenin、E-caderin、Fibro及Vimentin的表达水平明显改变,P<0.05。10)Elisa能够检测到MDSCs上清中TGF-β、IL-6、IL-10、IL-8及TNF-α蛋白的表达。11)TGF-β、IL-6和IL-10分别处理肿瘤细胞TE7,只有TGF-β处理的细胞,MAEL的表达升高,P<0.05。12)TGF-β处理过的TE7和TE1细胞,MAEL、p Smad2及p Smad3蛋白的表达增加,P<0.05;TGF-β抑制剂处理后,MAEL、p Smad2及p Smad3蛋白表达下调,P<0.05。小结1)在食管鳞癌组织中,IL-8的表达高于癌旁正常组织,且与MAEL的表达及患者的生存期相关,提示IL-8可能作为食管癌患者预后的一个指标。2)MAEL过表达或敲低,IL-8对MDSCs的招募能力升高或下降。3)在食管鳞癌中,MAEL调控IL-8是通过激活Akt1/Rel A信号通路实现的。4)MDSCs上清中的TGF-β能够上调MAEL是通过激活Smad2/Smad3实现的结论1)MAEL在食管鳞癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织,与患者的临床参数及预后相关,并且能够影响食管癌细胞的增殖、自我更新能力及干性。2)MAEL通过激活Akt1/Rel A信号通路调控IL-8,招募MDSCs到肿瘤部位,MDSCs分泌的TGF-β通过激活Smad2/Smad3来调控MAEL。