研究背景目前人工电子心脏起搏器是病窦综合征、重度房室传导阻滞等缓慢型心律失常的首选治疗方案,且临床适应证已扩展到如顽固性心’力衰竭、心室纤颤等非传导系统疾病的治疗。我国人工电子起搏器植入量已逾每百万人10台,且每年15%的速度递增,而欧美发达国家每百万人已达486台以上。电子起搏器用于临床已达半个多世纪,在其应用过程中也暴露出来一些缺陷和问题,包括电极断裂、感染、静脉血栓形成、绝缘性的破坏、电池寿命有限、更换电池需重新手术等。此外,儿童患者随着年龄的增长,最初安装的起搏器型号、电极和脉冲发生器位置将不会适合,也带来一些问题。近年来,随着分子生物学的进展,人们正试图研究开发人类自己的生物起搏器。心脏生物起搏器是利用生命科学及其相关技术,对机体心脏受损节律点或有传导障碍的传导组织进行修复或替代,以恢复机体心脏自身的起搏和传导功能。当前心脏生物起搏构建的主要策略有基因治疗和细胞治疗。细胞治疗主要是通过移植外源性细胞,主要包括干细胞(骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞)和组织细胞(窦房结细胞)两类,因其具有起搏特性、可与宿主细胞形成电偶联而构建生物心脏起搏器。从目前已有研究结果来看组织细胞取材,免疫排斥,定向分化,伦理观念,成瘤性等问题难以克服。基因治疗一般通过以下三种方法产生起搏活动：(1)过度表达神经激素受体(β2肾上腺素受体)基因增加心房电活动。(2)过度表达或人造工程化起搏电流(HCN2)基因。(3)基因控制内向整流钾电流(Ik1),改变心室肌细胞钾电流的平衡,使心室肌细胞产生自律性。其中前两种方法,因较低频率的生物起搏心率,难以满足心脏起博的需要。近年研究发现,成人心室肌细胞有潜在的起搏活性,但是因受到内向整流钾电流(Ik1)使静息膜电位保持在负电位而抑制了兴奋性。Ik1具有强内向整流特性,能使静息膜电位稳定于负值水平,其通道Kir2.1由KCNJ2基因编码,在心房和心室高度表达,而有自律性的窦房结细胞却缺乏这种电流通道。近期Silva J等的研究发现抑制心室肌细胞的Ik1电流达81%以后,心室肌细胞就出现自发性动作电位,而且心室肌细胞内在搏动频率随着Ik1电流抑制率的增加而增加。2002年Miake等报道用基因工程构造Kir2.1AAA基因,其编码的IKl通道是没有功能、非活性的,因此利用负显性法抑制心室肌细胞的Ikl电流。该研究在未抑制心脏正常兴奋性的情况下于豚鼠心脏诱导出了起源于心室肌细胞的自发起搏活性,并且心率比窦房结快,被称为发明了世界上第一种生物心脏起搏器,为生物起搏器的概念提供了证据。同时动物实验表明完全阻断KCNJ2基因的表达,可导致其他心律失常畸形出现。为此,我们要对KCNJ2基因的表达进行实验研究,使用RNA干扰方法封闭KCNJ2基因,抑制Ik1电流,以观察心室肌细胞各方面变化,从而为将RNA干扰用于生物起搏器的制造提供实验基础。RNA干扰(RNA interference, RNAi)能在转录水平、转录后水平和翻译水平上特异性阻断基因表达,是由双链RNA(dsRNA)诱导的同源mRNA降解的过程。RNA干扰现象最早在秀丽新小杆线虫中发现,随着对RNA干扰研究的不断深入,人们已经能够根据RNA干扰的原理,人工合成siRNAs (small interference RNA)使用能表达siRNAs的载体去诱导哺乳动物细胞特异的基因沉默。RNAi是一种高效的分子生物学实验技术,阻断目的基因表达具有高特异性、高度稳定性,且shRNA (short hairpin interference RNA)的干扰效果比siRNAs好。RNAi的实施步骤：(1)选择靶基因(2)选择靶基因上的靶位点(3)选取基因功能检测方法(4)筛选有效干扰靶位点(5)构建表达载体用于基因治疗。我们课题组前期研究已筛选出了KCNJ2基因mRNA上沉默效果最明显的干扰位点,即+361～+379碱基。重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)是去除了AAV基因组rep和cap基因换以外源基因及表达元件,经改造包装后的病毒形式。rAAV作为基因治疗载体的优势主要有：①AAV是人源性病毒,对人体无致病性,产生的免疫反应较轻,重组AAV去除了野生型AAV基因组96%,不表达任何病毒自身蛋白基因,安全性高。②AAV定点整合基因,能较稳定的存在,从而避免了像其它病毒那样随机整合而可能导致原癌基因激活和抑癌基因失活的危险。③AAV介导的外源基因可以在细胞内持续稳定表达不被降解。④AAV的宿主范围很广,包括神经细胞、内皮细胞、肝细胞等。⑤具有较好的热稳定性和抗酸碱性。因此,AAV已经成为目前基因治疗中最有优势的新型载体,我们选择rAAV做为基因载体转染心室肌细胞。本课题应用RNA干扰技术,将筛选出的对KCNJ2基因最具抑制shRNA的编码DNAs插入AAV构建rAAV表达载体,转染正常大鼠心肌细胞,使其成为起搏细胞,从而为生物起博器的研究及临床应用提供理论和实验依据。第一部分新生大鼠原代心室肌细胞的培养和活力观察研究目的获取、培养高纯度原代大鼠心室肌细胞,为后续实验提供实验基础。研究方法应用0.1%胰蛋白酶分离消化心肌组织,通过差速贴壁和添加Brdu化学方法纯化心肌细胞,用特异抗体抗α-actin和抗myosin进行细胞免疫组化,测定心肌细胞纯度,分别在培养的第3,6,9天在倒置显微镜下计数心肌细胞的搏动频率,观察培养细胞活力。研究结果即刻细胞存活率达94.6%,心肌细胞的纯度达95%,培养的心肌细胞在第3,6,9天的活力无差异。第二部分腺相关病毒载体rAAV2-EGFP-U6-kir2.1-shRNA的制备研究目的制备重组含有针对大鼠心肌细胞KCNJ2基因mRNA的特异性shRNA的腺相关病毒表达载体rAAV2-EGFP-U6-kir2.1-shRNA.研究方法据前期研究已筛选出了KCNJ2基因mRNA上沉默效果最明显的干扰位点,采用AAV载体质粒转染包装细胞BHK-21细胞),培养传代达到需求细胞量后用杂合有AAV元件的辅助病毒(HSV2-rc/-UL2)感染包装细胞,裂解细胞,氯仿抽提及柱纯化大规模制备腺相关病毒载体rAAV2-EGFP-U6-kir2.1-shRNA.研究结果制备的rAAV载体经酶切鉴定和测序证实构建成功,无任何碱基突变。第三部分rAAV介导的RNA干扰对大鼠心室肌细胞KCNJ2基因表达和搏动频率的影响研究目的1.确定rAAV载体对大鼠心肌细胞最佳感染复数MOI)。2.观察心肌细胞感染rAAV后搏动频率的变化。3.观察rAAV感染心肌细胞后KCNJ2基因mRNA和Kir2.1蛋白表达的变化。研究方法将培养的新生Wistar大鼠心肌细胞分为三组：(1)实验组：感染rAAV2-EGFP-U6-kir2.1-shRNA:(2)阴性病毒对照组：感染空白病毒rAAV2:(3)空白对照组：未做任何处理。实时荧光定量RT-PCR检测出mRNA的沉默效率,Western-blot检测蛋白表达抑制情况。研究结果：1.确定了rAAV载体感染心肌细胞的最佳MOI值,1×106vp/cell。2. rAAV介导的RNAi使心室肌细胞搏动频率增加3. rAAV介导的RNAi抑制了心室肌细胞KCNJ2基因mRNA和Kir2.1蛋白表达。