论文部分内容阅读
囊泡病毒(ascovirus)是一类较新发现的含有大分子双链DNA基因组的昆虫病毒。囊泡病毒主要侵染鳞翅目夜蛾科昆虫，引起寄主昆虫产生慢性致死病。囊泡病毒侵染使细胞裂解产生包含病毒粒子的囊泡，囊泡在血淋巴中积累，使血淋巴呈乳白色。囊泡病毒侵染形成包含病毒粒子囊泡的过程类似于凋亡小体的形成过程，囊泡病毒通过凋亡形成囊泡而不是凋亡小体。本研究以HvAV-3h为实验对象，拟通过研究HvAV-3h侵染与细胞凋亡的关系及决定凋亡过程的基因为囊泡病毒侵染形成囊泡提供新的理论依据。主要结果如下: 快速测定囊泡病毒滴度方法的建立。通过测定HvAV-3h侵染细胞不同时期的细胞凋亡率并结合显微观察研究结果确定病毒凋亡检测的最适侵染时间为24h p.i.。梯度稀释病毒原液侵染细胞24h后台盼蓝染色计数染色细胞个数并计算死细胞率。病毒侵染组每孔的细胞死亡率高于对照组则判定为病毒侵染孔，否则为病毒未侵染孔。并根据Reed-Muench的方法测定病毒的滴度为5.62×108TCID50/mL。 HvAV-3h侵染细胞12h诱导细胞凋亡，但病毒侵染24h时能抑制由放线菌素d(ActD)引起的细胞凋亡。分析HvAV-3h基因组序列发现HvAV-3h含有5个iap-like基因，分别编码IAP-1到IAP-5蛋白。HvAV-3h IAPs蛋白结构域分析结果表明:只有IAP-2含有一个类BIR结构域和一个RING结构域。表达谱分析结果表明:IAP-1和IAP-2在病毒侵染9h时有表达高峰，另一表达高峰分别在病毒侵染21h和27h;IAP-3仅在24h p.i.有一个表达高峰;而IAP-4和IAP-5在病毒侵染过程中表达量变化不明显。 通过构建瞬时表达IAPs的质粒，瞬时转染后测定细胞凋亡率，结果表明:瞬时表达IAPs的质粒均无诱导凋亡活性。瞬时转染表达质粒后用ActD诱导细胞凋亡，流式细胞术检测细胞凋亡率及测定caspase-3活性结果表明:只有IAP-2具有抑制细胞凋亡活性。通过构建过表达IAPs的稳定细胞系进一步验证IAP-2抗凋亡活性的结果表明:IAP-2能抑制由ActD诱导的细胞凋亡。因此，IAP-2可能在HvAV-3h侵染细胞抑制由ActD引起的细胞凋亡中起重要作用。