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目的:通过对同月龄无菌(Germ free,GF)级、无特定病原体(Specific pathogen free,SPF)级、清洁(Clean,CL)级BALB/c小鼠,局部组织(肠道)和外周免疫器官(脾脏)中调节性T细胞(Regulatory cells,Treg)TCRβ链CDR3组库的组成和特征性分析,初步探究肠道共生微生物的差异性组成对BALB/c小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞耐受性和应答功能的影响,为GF、SPF、CL级BALB/c小鼠中Treg细胞的机制及应用研究提供新的思路、监测技术和可供参考的基础数据。方法:1.从第三军医大学基础部实验动物学教研室,购买4月龄GF级、SPF级CL级BALB/c小鼠各3只。9只BALB/c小鼠的研究样本命名为:GF1-SP(GF级1号脾脏组织),GF1-In(GF级1号肠道组织)GF2-SP(GF级2号脾脏组织),GF2-In(GF级2号肠道组织)GF3-SP(GF级3号脾脏组织),GF3-In(GF级3号肠道组织)SPF1-SP(SPF级1号脾脏组织),SPF1-In(SPF级1号肠道组织),SPF2-SP(SPF级2号脾脏组织),SPF2-In(SPF级2号肠道组织)SPF3-SP(SPF级3号脾脏组织),SPF3-In(SPF级3号肠道组织)CL1-SP(CL级1号脾脏组织),CL1-In(CL级1号肠道组织)CL2-SP(CL级2号脾脏组织),CL2-In(CL级2号肠道组织)CL3-SP(CL级3号脾脏组织),CL3-In(CL级3号肠道组织)2.分别采集9只BALB/c小鼠的脾脏和肠道组织,采用美天旎Treg磁珠分选试剂盒分选出脾脏和肠道中CD4+CD25+Treg细胞。3.经流式分析技术鉴定所分选出的每个样本中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞含量达80%左右,并提取所有样本基因组DNA。4.采集各级别共9只BALB/c小鼠粪便样本,送华大基因公司完成粪便微生物基因组的测序。5.经美国Adaptive Biotechnologies Immuno SEQ公司鉴定,各送检样本基因组DNA浓度和纯度符合建库及测序要求后,对9只不同级别BALB/c小鼠的脾脏和肠道组织中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞TCRβ链CDR3组库进行构建并且完成Illumina Solexa高通量测序。6.对9只BLAB/c小鼠脾脏和肠道组织中Treg细胞TCRβ链CDR3组库的组成和特征进行分析,测序后对获得的原始数据经以下原则分类筛选:(1)Total CDR3序列;(2)Total In-frame CDR3序列;(3)Unique CDR3序列;(4)Unique In-frame CDR3序列;(5)Productive序列。最后每个样本以Productive序列作为基础进行分析,从而获得每个样本中Treg细胞TCRβ链CDR3组库的CDR3克隆水平、TRBV、TRBJ基因取用和配对情况,以及CDR3氨基酸构成等,最后利用Graphpad软件、Hem I软件和Draw Venn Diagram在线软件进行进一步的分析及统计。7.将3种不同级别BALB/c小鼠共9个粪便样本送华大基因公司做粪便微生物基因组测序,通过PCR扩增完成质检后将PCR扩增后的序列拼接成Tags,随后将处理过的Clean Tags进行OTU聚类,然后通过对OTU注释完成OTU的物种分类,最后运用相关软件分析粪便中微生物物种的多样性和丰度值。8.将华大基因公司所提供的粪便测序结果,同美国SEQ公司Illumina Solexa高通量测序结果进行对比分析。结果:1.实验共获得17个样本肠道和脾脏Treg TCRβ链CDR3组库功能性独特序列/功能性总序列数目分别为:GF1-In:100/129 GF1-SP:18452/25891 GF2-In:47/59GF2-SP:2616/3880 GF3-In:100/123 GF3-SP:19131/26071SPF1-In:59/77 SPF1-SP:19798/27897 SPF2-In:29/36SPF2-SP:41709/60573 SPF3-In:576/1116 SPF3-SP:(组库构建未成功)CL1-In:133/172 CL1-SP:12021/16528 CL2-In:63/80CL2-SP:19390/26116 CL3-In:17/20 CL3-SP:19368/25864.2.17个样本肠道和脾脏Treg TCRβ链CDR3组库TRBV-TRBJ基因优势配对:(1)9个肠道样本中Treg TCRβ链CDR3组库TRBV、TRBJ基因家族优势配对:GF组3只BALB/c小鼠高频取用(>3%)为TRBV19-01-TRBJ02-07;TRBV20-01-TRBJ02-07;TRBV13-02-TRBJ02-01。SPF组3只BALB/c小鼠高频取用(>3%)为TRBV19-01-TRBJ02-07;TRBV13-01-TRBJ02-01。CL组3只BALB/c小鼠高频取用(>3%)为TRBV19-01-TRBJ02-07。(2)8个脾脏样本中Treg TCRβ链CDR3组库TRBV-TRBJ基因优势配对:GF组3只BALB/c小鼠高频取用(>2%)为TRBV13-02-TRBJ02-07,TRBV05-01-TRBJ02-07,TRBV13-01-TRBJ02-07,TRBV19-01-TRBJ02-07,TRBV31-01-TRBJ02-07。SPF组2只BALB/c小鼠高频取用(>2%)为TRBV05-01-TRBJ02-07,TRBV01-01-TRBJ02-07,TRBV02-01-TRBJ02-07,TRBV04-01-TRBJ02-07。CL组3只BALB/c小鼠高频取用(>2%)为TRBV05-01-TRBJ02-07,TRBV19-01-TRBJ02-07,TRBV01-01-TRBJ02-07,TRBV02-01-TRBJ02-07。3.17个样本肠道和脾脏Treg TCRβ链CDR3组库TRBV、TRBJ基因家族中高频取用:(1)TRBJ基因家族在BALB/c小鼠肠道Treg TCRβ链CDR3组库中前2个优势取用基因:GF组前2个优势取用为TRBJ02-07和TRBJ02-01;SPF组前2个优势取用为TRBJ02-07和TRBJ01-04;CL组前2个优势取用为TRBJ02-07和TRBJ01-04。(2)TRBJ基因家族在BALB/c小鼠脾脏Treg TCRβ链CDR3组库中前2个优势取用基因:GF组前2个优势取用为TRBJ02-07和TRBJ01-04;SPF组前2个优势取用为TRBJ02-07和TRBJ01-04;CL组前3个优势取用为:TRBJ02-07和TRBJ01-04。(3)TRBV基因家族在BALB/c小鼠肠道中前2个优势取用基因:GF组前2个优势取用为TRBV19-01和TRBV13-02;SPF组前2个优势取用为TRBV19-01和TRBV05-01;CL组前2个优势取用为TRBV19-01和TRBV05-01。(4)TRBV基因家族在BALB/c小鼠脾脏中前2个优势取用基因:GF组前2个优势取用为TRBV19-01、TRBV05-01;SPF组前2个优势取用为TRBV19-01、TRBV05-01;CL组前2个优势取用为TRBV19-01、TRBV05-01。4.17个样本肠道和脾脏Treg TCRβCDR3 AA取用和长度分布:(1)17个实验样本中Treg TCRβCDR3 AA取用前2种高频氨基酸均为丝氨酸(S)和甘氨酸(G),其中均以丝氨酸(S)取用为主。(2)CL级和GF级BALB/c小鼠12个样本中,Treg TCRβCDR3 AA长度均是以12个氨基酸长度为主的钟型分布。SPF级BALB/c小鼠5个样本中除SPF1-In、SPF1-SP样本是以13个氨基酸长度为主的钟型分布,其余SPF2-In、SPF2-SP、SPF3-In也均是以12个氨基酸长度为主的钟型分布。5.17个样本肠道和脾脏Treg TCRβCDR3核苷酸的插入与剪切:17个实验样本中Treg TCRβCDR3核苷酸的插入与剪切均未见明显差异性表达。6.17个样本肠道和脾脏Treg TCRβCDR3的克隆扩增情况:(1)17个实验样本反辛普森指数(1/DS)分别为:GF1-In:229 GF1-SP:19670 GF2-In:131GF2-SP:2359 GF3-In:277 GF3-SP:20622SPF1-In:127 SPF1-SP:9120 SPF2-In:52SPF2-SP:15141 SPF3-In:130CL1-In:229.7 CL1-SP:19670 CL2-In:64CL2-SP:18365 CL3-In:47 CL3-SP:13346(2)17个样本克隆扩增前5条序列分析:仅1只BALB/c小鼠(SPF-1)脾脏和肠道中出现相同的CDR3氨基酸序列CASSDGGSGNTLYF。17个实验样本中均出现高度保守的氨基酸序列YEQY和NTLY。(3)3种不同级别BALB/c小鼠脾脏Treg TCRβCDR3组库中大部分克隆增值均呈低频表现(<0.02%总TCR库)。CL级BALB/c小鼠脾脏中高频克隆(>0.08%总TCR库)最多,其次为SPF级,最少为GF级。(4)3种不同级别BALB/c小鼠肠道Treg TCRβCDR3组库克隆增值程度中,SPF级、CL级克隆增值呈高频表现(>2%占总TCR库),GF级克隆增值程度呈中频表现(<2%占总TCR库)。7.17个样本肠道和脾脏Treg TCRβCDR3区独特的AA序列重叠情况:(1)GF级、SPF级、CL级同级别BALB/c小鼠肠道Treg TCRβCDR3中独特AA序列比较中未见重叠序列,而同级别GF级BALB/c小鼠脾脏Treg TCRβCDR3独特AA重叠序列为20条,同级别SPF级BALB/c小鼠脾脏Treg TCRβCDR3中独特AA重叠序列为1条,同级别CL级BALB/c小鼠脾脏Treg TCRβCDR3中独特AA重叠序列为178条。(2)3组不同级别(GF1-In、SPF1-In、CL1-In;GF2-In、SPF2-In、CL2-In;GF3-In、SPF3-In、CL3-In)BALB/c小鼠肠道Treg TCRβCDR3中独特AA重叠序列为0条,3组不同级别(GF1-SP、SPF1-SP、CL1-SP;GF2-SP、SPF2-SP、CL2-SP;GF3-SP、CL3-SP)BALB/c小鼠脾脏Treg TCRβCDR3中独特AA重叠序列分别为:145条、0条、308条。8.17个样本肠道和脾脏TCRβCDR3区氨基酸(AA)的长度:除1只BALB/c小鼠(SPF1)脾脏和肠道,出现以13条AA为主的标准钟型分布外,其余15个样本均呈以12条AA为主的标准钟型分布。9.9只BALB/c小鼠粪便粪便微生物基因测序:(1)序列总条数:GF1(MG-4):43874 GF2(MG-5):0 GF3(MG-6):0SPF1:45503 SPF2:44850 SPF3:45237CL1:44619 CL2:44400 CL3:44979(2)OUT丰度值:GF1(MG-4):125SPF1:287 SPF2:294 SPF3:291CL1:327 CL2:305 CL3:279(2)从微生物的门、纲、目、科、属的分类中发现GF小鼠的物种多样性非常低,而SPF和CL级小鼠的物种丰度则明显增多,并且SPF和CL级小鼠之间所拥有的优势种类出现一定差异性。10.9只BALB/c小鼠肠道、脾脏、肠系膜淋巴结组织切片:(1)脾脏白髓外围边缘带在GF级BALB/c小鼠中缩小最为明显,其次是SPF级,缩小范围最小的为CL级。(2)肠道组织中GF级BALB/c小鼠肠绒毛中心血管生成受限、微绒毛变长,并且肠系膜淋巴结的中央区生发中心也明显缩小,而SPF级与CL级BALB/c小鼠的差异却不明显。结论:1.4月龄GF、SPF、CL级BALB/c小鼠有着不同的肠道微生物组成,可能和其不同的外周免疫组织器官的发育和组成相关,并且粪便中微生物的丰度和数量均与饲养环境中微生物的改变呈正相关。2.4月龄GF、SPF、CL级BALB/c小鼠肠道Treg TCRβCDR3组库中,高频独特CDR3AA序列的取用出现明显的差异,并且在TRBV、TRBJ基因家族的取用和配对中也表现出较大的异质性。GF、SPF、CL级BALB/c小鼠脾脏Treg TCRβCDR3组库中,仅部分TRBV、TRBJ基因家族的取用和配对出现差异性改变。GF、SPF、CL级BALB/c小鼠不同的肠道微生物组成可能主要影响局部Treg CDR3的组成,并未改变循环免疫系统Treg CDR3组库的总体特性。