溶菌酶是一种广泛分布于血清，粘液和器官的抑菌蛋白。它是先天性免疫的重要组成部分，通过催化大多数细菌的细胞壁来起到抑菌作用。在水产养殖和家禽饲养的过程中，溶菌酶的使用可有效的避免抗生素的大量积累，对人体的健康不会构成影响。溶菌酶在生物体内的表达量是有限的，所以通过提取的方法操作太难，合成一段氨基酸序列的成本太高，随着生物技术的不断发展，利用基因工程的方法，在微生物中表达具有高活性的溶菌酶对于溶菌酶的产业应用具有很好的前景。C型溶菌酶（Chicken-type）即鸡蛋清溶菌酶，它最初是从鸡蛋清中提取得到的，唯一同时存在于脊椎动物、原索动物和无脊椎动物中的类型，也是目前研究得最广泛、最透彻的类型。C型溶菌酶具有典型的结构特征，即8个半胱氨酸残基和2个酶促催化位点，8个半胱氨酸形成的4对二硫键对于稳定溶菌酶的构象起着重要作用，目前，对于C型溶菌酶的研究主要是一些溶菌酶的组织表达及活性分析，但是利用基因工程的方法来实现溶菌酶异源重组表达的研究却不多。　　本实验主要以斑点叉尾鮰C型溶菌酶成熟肽为研究对象，三部分实验共设计了四段重组基因，分别是：斑点叉尾鮰C型溶菌酶天然成熟肽基因cflyc（1）；为了提高目的蛋白的表达量，根据毕赤酵母密码子偏爱性进行优化的成熟肽基因，并且进行N端优化并添加His标签（2）；为了提高目的蛋白的活性，对其N端进行修改，同时设计了C端添加His标签（3）和不添加His标签（4）两种重组方式。我们选用原核克隆质粒pMD19-T作为载体，目的基因的5末端和3末端分别添加Xho I和Xba I限制性酶切位点。我们选取的表达载体是具有穿梭功能的载体质粒pPICZαA，同时pPICZαA上含有分泌表达的引导因子α因子信号肽，目的蛋白的胞外分泌更有利于收集纯化。实验选取毕赤酵母X-33作为表达菌株，这种菌株内含有可利用甲醇进行诱导转录的醇氧化酶基因同时启动目的基因的转录表达。　　第一部分：编码斑点叉尾鮰C型溶菌酶成熟肽的cDNA的获取是以实验室留存的斑点叉尾鮰鳃的第一股反转录cDNA为模板，根据NCBI登录的mRNA序列设计引物，从而获得成熟肽的基因，然后以此成熟肽的DNA片段为模板，通过PCR的方法在成熟肽基因的5端添加信号肽酶切位点，3端添加6个组氨酸的碱基序列和终止密码子。将测序正确的pMD19-T-cflyc双酶切后与表达载体pPICZαA连接，构建真核重组表达载体pPICZαA-cflyc。利用线性化限制性酶Sac I对重组质粒线性化，利用电转化的方法转入毕赤酵母X-33中，通过博来霉素抗性和甲醇利用快速型筛选，酵母基因组PCR验证，最后成功构建含目的基因的重组酵母。经0.5％甲醇诱导，在初始pH6.0和29℃下表达120小时,获得了15.1kDa大小的相对稳定的斑点叉尾鮰C型溶菌酶。利用Ni-NTA柱固化金属离子亲和层析得到纯化的样品。进一步的MALDI-TOF-TOF质谱鉴定证明，纯化得到的是重组C型溶菌酶。福林酚法测得其表达量为2.75mg/L。通过琼脂平板扩散法和酶活力测定，表明该重组C型溶菌酶对枯草牙孢杆菌具有一定的抑菌活性。　　第二部分，为了提高目的基因的表达量，根据毕赤酵母密码子偏爱性，对斑点叉尾鮰C型溶菌酶成熟肽基因密码子进行优化，然后送公司进行合成。此次优化重组的溶菌酶基因ocflyc的两端进行了修改，由于信号肽酶切位点与目的蛋白N末端的两个氨基酸相同，所以有被切掉的可能，这次直接去掉目的基因5端的两个氨基酸的密码子碱基，6个组氨酸的碱基序列被加在了5端。在pH6.0和29℃的条件下优化不同的表达条件，如表达时间、诱导剂甲醇的量、不同的培养基，最后实验数据显示利用BMM培养基，1%甲醇，120小时可实现最高表达量。Western blot初步验证为目的蛋白，进一步的MALDI-TOF-TOF质谱鉴定证明，纯化得到的是重组 C型溶菌酶。纯化后测取其表达量为9mg/L。抑菌实验显示抑菌效果并没有提高，所以需要进一步的重组设计来提高目的蛋白的活性。　　第三部分，考虑到目的蛋白活性的问题，本次实验在第二章的基础上对目的蛋白基因进一步优化，此次基因设计主要考虑两个方面，一方面，考虑到信号肽酶的作用，此次实验对目的序列的N末端进行修改，由Lys-Arg残基改成Lys-Val残基。另一方面，C末端的6个组氨酸可能干扰目的蛋白的三维结构和稳定性，这可能对目的蛋白的抑菌活性有很大的影响，此次设计了两组实验，一组是在C-末端添加组氨酸标签（hocflyc），另一组不添加（wocflyc）。实验结果显示，不添加组氨酸的酵母发酵上清对单增李斯特菌具有很好的抑制作用。这个实验证明，组氨酸标签的添加对目的蛋白的活性有一定的影响。实验构建的酵母表达系统对不含组氨酸标签的斑点叉尾鮰C型溶菌酶有着很成功的胞外分泌表达，可作为低温冷藏食品的绿色保鲜剂。