论文部分内容阅读
多基因单表达载体的转化是基因工程研究的热点之一。本研究通过根癌农杆菌介导法,以卡那霉素作为筛选标记，利用植物表达载体p096899(含有BtCry1Ac和NTHK1)、p09687199(含有BtCry1Ac、BtCry3A和NTHK1)对烟草进行遗传转化，获得含有BtCry1Ac、BtCry3A和NTHK1的烟草植株，对外源基因的DNA水平和蛋白水平进行检测。进一步以此植物表达载体转化欧美107杨，获得转BtCry1Ac、BtCry3A和NTHK1的欧美107杨株系。主要研究结论如下:1.优化了烟草遗传转化再生体系，烟草转化的卡那霉素临界筛选浓度为50mg·L-1，抗生素头孢噻肟钠的抑菌浓度为200mg·L-l。2.采用农杆菌介导法，用植物表达载体载体p096899和p09687199转化烟草，获得抗性稳定的无性系各10个。经PCR检测，初步证明目的基因已整合到烟草的基因组中。3.荧光定量PCR证明已将BtCry1Ac和BtCry3A整合到烟草基因组中。BtCry1A基因的转录峰度为1.08E+04~3.40E+05；BtCry3A基因的转录峰度为3.23E+05~1.34E+06。由于烟草基因组中本身含有NTHK1基因，无法进行定量检测。4.对烟草转化植株进行ELISA检测，大部分转基因株系中Bt1和Bt3毒蛋白表达量均高于对照，Bt1毒蛋白表达量最高达到总蛋白的0.0287%和Bt3毒蛋白的表达量最高达到0.3792%。饲虫试验结果表明Bt毒蛋白含量高的株系对斜纹夜蛾的毒杀作用也高，7d后死亡率最高达到99%，对照仅为41%。5.对组培条件下的转基因烟草叶盘在不同NaCl浓度的分化培养基中进行耐盐性鉴定，胁迫条件下生长表型均优于野生型对照植株，初步证明NHTK1基因的转入在一定程度上提高了烟草的耐盐能力。6.确定欧美107杨遗传转化过程中选择压浓度，转化欧美107杨的卡那霉素临界筛选浓度为30mg·L-1，抗生素头孢噻肟钠的抑菌浓度为400mg·L-l。7.采用农杆菌介导法，以卡那霉素作为转化植株的筛选标记，分别用植株转化载体p096899、p09687199对欧美107杨进行遗传转化，分别获得抗性稳定的无性系8个。经PCR检测初步证明目的基因已整合到欧美107杨的基因组中。