细胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility, CMS)普遍存在于高等植物中,是杂种优势广泛利用的基础,因此探讨水稻细胞质雄性不育和育性恢复的分子机理对于我们进一步开展水稻杂交优势利用具有重要意义。细胞质雄性不育的主要特点为雌性生殖系统以及营养器官发育正常,而雄性生殖系统不能正常发育,不能产生有功能的花粉或者花药不开裂。研究者们通过长期的积累发现,线粒体基因组的突变可能是CMS产生的关键因素,而且线粒体的功能与代谢和CMS紧密相关。目前CMS的研究主要集中于水稻花药线粒体的研究,而对苗期线粒体的功能知之甚少,为此,我们以水稻红莲型(HL)细胞质雄性不育系粤泰A (YtA)和保持系粤泰B (YtB)为材料,对红莲型不育水稻苗期线粒体功能进行了分析,主要结果如下：1、已有的研究表明,YtA小孢子发生败育阶段由于抗氧化系统变弱,ROS的积累增多,诱导细胞发生异常的细胞凋亡。为深入研究YtA和YtB氧化伤害诱导细胞凋亡的分子机理,我们以H202处理水稻红莲型细胞质雄性不育系YtA和保持系YtB黄化苗,并作了相应生理生化和分子生物学的研究,发现不育系比保持系对H2O2敏感,也更易检测到细胞凋亡(Program cell death, PCD)相关的生理指标。在50mM H2O2处理条件下,红莲不育系YtA中抗氧化物酶活性有所下降,活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的含量迅速攀升,但保持系YtB一直变化相对缓慢,说明不育系YtA对H202比较敏感,导致氧化伤害更加严重,进而导致YtA中细胞核DNA的断裂和死亡细胞数目增多。同时,酶活分析显示,线粒体电子传递链(mitochondria electron transfer chain, mtETC)的活性也明显下调,ATP含量和线粒体膜电位相对保持系显著下降,线粒体细胞色素C从线粒体释放,充分说明YtA的线粒体参与了ROS诱导细胞发生凋亡；同时,也显示了YtA的线粒体可能对于ROS更加敏感。根据以上实验结果,们推测雄性不育相关蛋白ORFH79有可能为组成型表达的毒性蛋白,在苗期表达量较低,但是在外部H2O2胁迫的协同作用下,放大了该蛋白的伤害程度,更易诱导苗期YtA细胞发生凋亡。2、在动物肝脏细胞以及玉米细胞中存在两种不同荧光密度的线粒体,分别为高密度荧光线粒体(high density of fluorescence mitochondria populations,HFP),低密度荧光线粒体(LFP),动物中HFP代表没有完全成熟的线粒体受到线粒体能量状态的影响,具有重要的生物学意义。为探索红莲型不育水稻线粒体状态,我们利用流式细胞仪分析罗丹明染色后的水稻黄花苗线粒体发现：YtA和YtB的流式细胞仪结果均有两个峰,而且YtA中HFP的含量较高为50%,而可育系YtB中HFP含量相对较低为29%,我们通过H2O2体外处理实验发现LFP/HFP的比例的变化和ATP含量的变化以及ROS的含量具有相关性。因为体外过氧化物处理,YtA的活性氧含量快速升高引起了ATP含量更为快速的下降以及FO-F1-ATPase的酶活的降低,ATP含量的降低进一步加大LFP/HFP的比例的降低。暗示着水稻在H2O2处理条件下,HFP的含量会逐渐增多,说明和动物类似,YtA中含有较多不够成熟的线粒体HFP。此外脉冲电泳(PFGE)实验检测发现存在弥散的线粒体基因组DNA。说明不同基因组大小线粒体,不同荧光强度的线粒体可能共存于YtA和YtB线粒体中,它们通过LFP/HFP比例的变化来改变自身的生理、功能状态,而且这种功能上的转变会受到线粒体ATP含量以及FO-F1-ATPase的酶活调控。3、为深入研究红莲型不育水稻细胞质雄性不育的分子机制,我们构建了红莲型杂交水稻杂种F1花药噬菌体展示文库。首先提取红莲型不育水稻杂种Fl的二核期花药RNA后,分离纯化mRNA后反转成双链DNA,平末端化之后连接接头,酶切双链DNA连接并分离收集大于300bp的片段,连接载体体外包装后,成功构建未扩增库容量为1.03×106pfu/ml文库,文库重组率为100%,97%的插入片段大于300 bp,无任何rRNA以及基因组DNA的污染。为以后的分子生物学研究提供良好的技术平台。4、人类Bcl-2结合抗凋亡基因(Bcl-2-associated athanogene, BAG)作为抗凋亡蛋白BCL-2的相互作用蛋白被人们所认识,是目前植物中少数几个具有动物凋亡相关基因保守结构的家族基因。深入研究红莲型杂交水稻细胞凋亡相关的分子机理,我们利用人类Bcl-2结合抗凋亡基因保守结构序列,并结合Pfam以及Smart分析搜索到八个水稻BAG蛋白并选取其中一个深入分析,发现该基因的RNAi转基因植株和突变株都具有生长缓慢,植株矮小以及种子短小的的特点。强表达该基因的酵母菌株具有抗H2O2引起酵母死亡的功能,但是分别强表达该蛋白的的BAG结构域与Ubiquiting结构的酵母菌株并不具有该功能,说明该蛋白的功能必须通过这两个结构与协同作用才能实现。通过Western的结果表明该基因在和根部等生长旺盛的部位的表达比较多,说明该蛋白有可能是细胞生长的关键蛋白,它可以通过调控生长参与调控环境胁迫下的细胞死亡过程。此外我们还尝试利用噬菌体展示文库淘洗该蛋白的相互作用蛋白,后续工作有待继续。