基因芯片技术是上世纪90年代兴起，源于计算机集成化芯片理念的一门新技术。其实质就是利用Southern blot原理，以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息。该技术的出现为基因表达谱分析、新基因的发现、基因突变检测、多态性分析、基因组作图等提供了强有力的工具，使疾病的基因诊断、药物筛选等方面取得了重大突破。然而在基因芯片技术的推广及应用中，发现其实验结果容易受到来自芯片样品的准备、探针的打印、芯片的杂交、芯片的杂交后清洗、荧光信号采集等多个步骤因素的影响。因此需要严格控制芯片的实验流程，从而得到更科学更可信的实验数据。 芯片实验流程中最初始的阶段是样品的制备，也是影响后续实验效果的首要因素。样品（DNA或mRNA）的制备包括样品的分离纯化，扩增和标记等过程。分离纯化是芯片实验的第一步，也是最重要的一步，样品的质量会直接影响后面实验的效果，需要应用实验仪器对分离得到的样品进行有效的检测，保证得到的样品质量。在样品的标记过程中，目前使用最多的仍然是荧光标记。生物素标记法和放射性同位素标记法由于操作过程的复杂性和检测的要求更高，因此相对没有荧光标记应用的更为广泛。传统的荧光标记法有逆转录标记法和随机引物延伸法，在限制性扩增的基础上引进了通用引物限制性标记法，以及线性扩增荧光标记法。线性扩增标记因为能够如实反映样品的表达丰度，解决了非线性标记中出现的无法精确定量的缺陷，避免了不同基因表达丰度的微小差异由于PCR的几何扩增而扩大化，并且线性荧光标记法对核酸样品标记时所需要的初始样品量的波动范围在50ng至5μg之间，远远少于其他标记方法，非常适合某些稀有核酸样品的标记，因此在生物芯片的样品标记领域逐渐得到广泛应用。 探针的打印是将预先制备好的核酸探针置于96孔或384孔板内，以液滴的形式有序排列在经特殊处理的支持物上的过程。一个微集阵列打印系统需要稳定的硬件和精确的软件支持，从而保证芯片片基打印上的点阵能够正确反映样品的阵列排列。而影响阵列打印效果的最主要因素就是湿度和灰尘，高密度的微集阵列必须控制这两个因素，控制湿度以防止探针在打印过程中从样品板或打印针的细槽中蒸发。 对芯片技术的广泛研究建立了很多技术层面的方法来改善实验的效果，包括芯片阵列的设计，样品的标记方法的改进等，而样品杂交方法的选择则相对报道较少，其中一个原因就是Corning的CMT芯片杂交盒已经在芯片实验领域得到广泛应用，其实验的操作流程即将样品点到芯片阵列表面，调节一定的温度，杂交过夜即可。但是在芯片杂交过程中，由于液体表面张力的存在，会造成样品液滴在阵列表面呈现不均匀的分布，常常在液滴的边缘样品的量要低于中间的样品量，并且在杂交后的芯片扫描图上常常出现边缘效应（Edge-effect），从而影响对芯片杂交图像的分析。目前芯片杂交可以采取一种动态循环的方法中通过样品和芯片阵列表面进行接触来进行杂交反应，保证阵列上液-固相杂交反应的随机性，并且避免了液体表面张力的影响，单位体积内的样品与单位面积的阵列反应的概率相同，使得到的芯片数据更科学。 芯片的高通量一方面是是芯片技术的优势，另一方面也容易造成实验中芯片结果的不准确，以及如何进行数据分析的困难：在芯片实验过程中，选择不同的芯片片基，不同的标记杂交方法，以及所采用的不同的芯片杂交清洗平台，都会影响芯片实验的结果。因此，针对影响芯片实验的各种因素，需要对芯片实验过程进行质量控制（Quality assurance plan），来消除外加或操作因素产生的伪信号，提高芯片数据的科学性和可信性。目前的研究主要是从两个方面来进行：一是集中于具体样品标记方法、杂交方法等各个因素的改进，选择合适的标准化实验流程，来提高杂交信号的信噪比；二是结合生物信息学的思路和方法对芯片实验结果进行更有效的数据挖掘。但是前一种思路过于集中于单一环节的研究，无法从整体角度对芯片实验过程和数据进行科学分析，而生物信息学的数据挖掘又需要设计复杂的计算机软件和程序，增加了生物学工作研究的难度。因此，如何能够从芯片实验设计的角度，来对芯片实验整体过程进行质控分析，有待于深入研究。本研究立足于芯片的质控设计，探讨和研究不同的芯片质控方法在芯片探针检测的应用，并设计一种互杂交（Cross-hybridization）的实验方法，研究从实验整体设计出发提高芯片实验科学性的思路；同时在芯片杂交体系方面根据已有的实验平台原理，提出了夹心法的芯片杂交体系，为提高芯片重复性实验的数据科学性和可信性提供新的实验方法和研究思路。 本研究包括以下三个部分： 一．自杂交方法在生物芯片质控中的应用 应用RD-PCR技术构建人红白血病K562细胞正常生长情况下cDNA片段文库，从中选择克隆扩增，PCR产物应用Pixsys5500芯片打印仪进行点样，然后在BIO-RAD紫外交联仪下进行交联固定。同时提取K562细胞的总RNA，纯化后的mRNA分成两等份，应用通用引物限制性扩增标记方法分别标记荧光Cy3和Cy5，标记后的核酸样品和芯片进行杂交反应，然后在扫描仪下进行荧光信号的采集和数据分析。 结果发现，芯片阵列的探针信号清晰，背景相对较小，在杂交时两种相同基因片段，得到的探针信号为Cy3和Cy5红绿两种荧光颜色的叠加，由于两种荧光分子的大小不同，Cy5分子掺入cDNA链的效率比Cy3分子低，因此在芯片杂交图上的探针信号显示为偏黄色。在Cy3样品/Cy5样品分别为4/10，6/10，和8/10的不同比例下，芯片探针的两种荧光强度在8/10的浓度比例最为接近。因此，自杂交方法可以有效地检测样品的标记效率，但是通过探针的两种荧光强度差异来评估芯片本身的质量，从而用于芯片的质控，仍然需要避免不同荧光之间本身的差异；并且对于单通道的芯片实验，由于杂交时每种荧光物质标记的样品是单一性的和一张芯片进行杂交，因此无法应用比较两种荧光强度的自杂交方法来对芯片的实验效果进行检测。 二．互杂交方法的芯片质控设计研究 分离正常培养的K562细胞和青蒿素处理的K562细胞，提取其单个核细胞的总RNA，逆转录成cDNA后进行荧光标记，生成的cRNA再进行纯化，纯化后的两组样品各分成两等份，然后分别与安捷伦全基因组芯片进行杂交，操作同步骤进行，然后芯片扫描仪以及FeatureExtraction软件进行探针荧光信号的采集，采取四分位法对探针信号强度平衡至相同的信号强度均值，达到片间标准化，然后比较每组内样品的两次芯片杂交结果的重复性，和四张芯片整体荧光探针的检测率，两两分析两组样品组间以及组内两次实验的探针信号强度。 我们发现每两组芯片的探针检测率，即这两组共同检测出的探针数量与其探针平均数量的比值，分析芯片的探针检测重复性，在相同的样品间的一致性明显好过不同样品之间的比较结果。而在四分位法标准化数据的基础上，分析每组样品内两张芯片得到的探针信号强度，对照组中18235个探针被共同检测到，而有194个探针（1．1%）成为差异探针，两次实验数据相关性达到0．983，在处理组有19129个探针被检测到，有287（1．5%）成为差异探针，相关性为0．972。本研究通过对基因芯片实验得到的数据进行交叉分析和验证，包括探针检测率和信号强度相关性的比较，以求能够对芯片检测得到的数据，特别是两组样品具有同源性时实验数据的整理与验证提出新的思路和方法，提高芯片实验数据的可信度。 三．杂交体系对基因芯片探针荧光信号的作用研究 提取人慢性髓系白血病K562细胞株的mRNA，纯化后在紫外分光光度仪进行定量，纯化后的mRNA应用Cy5通用引物进行限制性扩增和荧光标记。然后在分成15μL的三等份，分别在CMT芯片杂交盒，安捷伦芯片杂交仪以及GeneTac自动化杂交仪中进行和K562 cDNA芯片杂交，使用安捷伦2565芯片扫描仪对杂交后的芯片结果进行扫描，分析三种不同杂交体系下的探针荧光信号强度，采用单向方差分析比较差异显著性，并对其进行多重比较，来评价三种杂交体系对探针信号强度的影响。在此基础上，应用自制的K562 cDNA芯片对设计的夹心法杂交体系进行验证，在芯片杂交时将样品置于两张芯片间同时进行杂交反应，并应用RT-PCR技术对得到的差异表达基因进行定量分析，从而为芯片重复性实验提供新的实验方法和思路。 我们发现将探针信号强度/背景信号强度大于等于2界定为阳性探针，利用计数资料的卡方检验来对阳性探针检测率进行分析，发现其三者之间的统计学差异具有显著性。同时对探针荧光强度的比较分析后发现，三种杂交体系信号强度差异具有显著性，Agilent和GeneTac两种杂交体系中的探针的信噪比更高。进一步研究，在我们设计的夹心法实验得到的两张芯片中Cy3和Cy5的荧光信号一致性非常高，同时应用RT-PCR技术对得到的差异表达基因进行定量分析，与我们芯片中的荧光比值Ratio的差异一致，也证明在应用这种杂交模式下得到的芯片结果是可信的。