论文部分内容阅读
目的:探讨胃癌患者发生第五转移的临床危险因素,为患者肿瘤临床分期及治疗方案的选择提供参考。方法:采取单中心回顾性研究的方法。选取自2017年1月至2019年12月期间,在我院胃肠外科接受胃癌根治性切除手术的患者。病例纳入标准:1.患者术后病理诊断为原发性胃腺癌;2.患者临床资料及病理资料完整;3.患者术前未接受新辅助治疗。通过单因素及多因素Logistic回归分析,筛选出胃癌发生第五转移的临床危险因素。结果:一共有1227例胃癌患者纳入本研究,其中有94例患者有第五转移的发生,第五转移发生率为7.7%。对第五转移阴性与第五转移阳性的两组患者进行比较,两组患者在年龄、体质指数、肿瘤分化程度、肿瘤发生部位、肿瘤神经侵犯、术前血清CEA及CA72-4水平方面没有显著统计学差异。两组患者在性别、肿瘤T分期、N分期、M分期、肿瘤大小、脉管侵犯、术前血清CA19-9水平方面存在差异,且具有显著统计学差异。单因素Logistic回归分析表明患者性别、肿瘤T分期、N分期、M分期、肿瘤大小、脉管侵犯、术前血清CA19-9水平与胃癌第五转移的发生具有相关性。而多因素Logistic回归分析表明患者性别、肿瘤T分期与肿瘤N分期是胃癌第五转移发生的临床独立危险因素。结论:在胃癌中,患者性别、肿瘤T分期与N分期是胃癌第五转移发生的独立危险因素。目的:研究YAP在胃癌组织及胃癌第五转移中的表达,探讨YAP与胃癌临床病理特征的关系。培养并建立胃癌第五转移原代细胞。方法:通过肿瘤基因表达数据库Oncomine检索YAP在胃癌中的表达情况。由The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库下载得到胃癌样本RNA测序数据,明确YAP表达量与胃癌临床病理特征的关系。对胃癌患者术后胃系膜进行大规模连续切片,明确胃癌第五转移的发生,并比较胃癌第五转移灶与原发灶YAP的表达差异。根据第一部分结果对胃癌第五转移发生的高危患者,取术后胃系膜进行原代第五转移细胞培养。结果:（1）胃癌组织较正常胃黏膜组织YAP的表达量增加;（2）在胃癌中,YAP表达量与肿瘤T分期相关,随肿瘤T分期的增加,YAP表达量升高;（3）在胃癌第五转移灶中,YAP的表达较原发灶升高;（4）成功培养胃癌第五转移原代细胞,并在体外实验中表现出良好的增殖与传代能力。结论:YAP在胃癌组织中表达升高,并与肿瘤T分期相关;在第五转移灶中,YAP表达量较原发灶进一步增加,提示YAP可能在胃癌第五转移的发生发展中起着重要的作用。成功培养并建立胃癌第五转移原代细胞。目的:探究YAP对胃癌第五转移原代细胞及胃癌细胞系肿瘤生物学行为的影响。方法:（1）应用Western blot检测第五转移原代细胞及胃癌细胞系中YAP的表达水平。（2）利用YAP过表达及敲减慢病毒感染第五转移原代细胞及胃癌细胞系,构建YAP过表达及敲减细胞系,并用Western blot和q RT-PCR检验其有效性。（3）应用Transwell迁移及侵袭实验,探寻YAP表达水平对第五转移原代细胞及胃癌细胞系迁移及侵袭能力的影响。（4）利用Western blot与免疫荧光实验检测YAP表达水平对第五转移原代细胞及胃癌细胞系EMT标志物表达的影响。（5）利用免疫荧光实验,检测YAP表达水平对第五转移原代细胞及胃癌细胞系细胞形态学的影响。（6）通过腹腔注射转移模型,验证YAP对第五转移原代细胞转移能力的影响。结果:（1）通过Western blot检测我们发现在第五转移原代细胞MV4中YAP表达明显增高,在胃癌细胞系中BGC-823细胞YAP表达较高,而MKN45细胞无明显YAP表达。（2）经YAP过表达慢病毒感染的MKN45细胞可以明显升高YAP蛋白及m RNA的表达,YAP敲减慢病毒可有效干扰第五转移原代细胞MV4与BGC-823细胞中YAP的表达。同时,通过Western blot与q RT-PCR实验检测,筛选出两条干扰效率较高的sh RNA序列。（3）敲减YAP后第五转移原代细胞MV4及BGC-823细胞的迁移及侵袭能力减弱,而过表达YAP后MKN45细胞的迁移及侵袭能力增强。（4）敲减YAP后MV4与BGC-823细胞中EMT上皮标志E-cadherin的表达升高,间质标志物Vimentin的表达降低,而过表达YAP后MKN45细胞中E-cadherin的表达显著下降,间质标志物Vimentin的表达升高。（5）敲减YAP后MV4与BGC-823细胞由原来的梭形变成类圆形,呈间质上皮样转化（MET）;而过表达YAP后,MKN45细胞由原来的类圆形变成长条梭形,呈上皮细胞间质转化（EMT）。（6）腹腔注射转移模型显示敲减YAP后明显减弱第五转移原代细胞腹腔种植转移能力。结论:YAP可促进胃癌第五转移原代细胞及胃癌细胞系迁移、侵袭、EMT与腹腔种植转移。目的:探讨YAP调控胃癌第五转移原代细胞及胃癌细胞迁移、侵袭及EMT的分子机制。方法:（1）检索GEO数据库,下载YAP在胃癌细胞中的转录组学数据。（2）通过差异基因分析,筛选出显著受YAP调控的基因。（3）利用DAVID软件进行基因本体论（Gene Ontology）分析,筛选出可能参与细胞EMT过程的基因。（4）通过差异表达比对与检索GEPIA肿瘤基因预后数据库,进一步筛选YAP调控胃癌细胞迁移侵袭的下游潜在基因。（5）通过小干扰RNA（si RNA）与过表达质粒,验证该基因对胃癌第五转移原代细胞及胃癌细胞迁移侵袭及EMT的影响。（5）通过Western blot及q RTPCR实验验证YAP对该基因蛋白水平及转录水平的调控。（6）通过JASPAR数据库预测该基因启动子区域是否存在YAP结合位点。（7）染色体免疫共沉淀实验验证YAP是否可结合于该基因启动子。（8）双荧光素酶报告基因实验验证YAP是否可调控该基因的转录活性。（9）通过Transwell实验验证干扰YAP对该基因的调控是否影响YAP介导的迁移侵袭。（10）通过回补实验验证该基因是否介导YAP对第五转移原代细胞及胃癌细胞促进迁移侵袭及EMT的作用。（11）在第五转移原代细胞腹腔种植转移样本及TCGA胃癌样本中验证该基因与YAP的表达相关性。结果:（1）基因表达谱芯片分析显示在过表达YAP-S127A的胃癌细胞中,差异基因可以富集至EMT通路。（2）差异基因分析显示共有41个基因可以被YAP显著调节。（3）通过DAVID软件基因本体论分析,CAV1、KRT18、KRT7与KRT80可被富集至细胞结构功能集。（4）差异基因显示CAV1可被YAP显著调控,且CAV1的表达与胃癌预后密切相关。（5）Transwell、Western blot及免疫荧光实验显示CAV1可以促进第五转移原代细胞及胃癌细胞的迁移、侵袭及EMT。（6）Western blot及q RT-PCR实验显示YAP可以从m RNA水平上调CAV1。（7）JASPAR数据库检索发现CAV1启动子存在YAP-TEAD结合位点,染色体免疫共沉淀实验证明YAP可结合于预测结合位点PEAK3。（8）双荧光素酶报告基因实验证明YAP可以增强CAV1转录活性。（9）Western blot及Transwell实验证明干扰YAP-TEAD结合,可影响YAP对CAV1的调控,且抑制YAP对胃癌细胞迁移、侵袭促进作用。（10）回补实验证明CAV1可以介导YAP对第五转移原代细胞及胃癌细胞促进迁移侵袭及EMT的作用。（11）在第五转移原代细胞腹腔种植转移样本及TCGA胃癌样本中YAP与CAV1的表达呈正相关性。结论:YAP通过结合于CAV1启动子促进其转录表达,进而促进第五转移原代细胞及胃癌细胞的迁移、侵袭及EMT。