CerS2基因过表达对甲状腺乳头状癌BCPAP细胞生长、增殖的影响

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目的:探讨CerS2基因过表达对甲状腺乳头状癌BCPAP细胞生长、增殖的影响。方法:1)采用pAdxsi重组腺病毒骨架载体构建人源重组CerS2腺病毒表达载体,并确认pAdxsi-CerS2-GFP腺病毒表达载体对BCPAP细胞株感染的最佳感染复数(MOI)、过表达高峰时间;2)将pAdxsi-GFP、pAdxsi-CerS2-GFP腺病毒表达载体分别感染BCPAP细胞,培养特定时间后,分别提取空白组(blank group)、空载组(pAdxsi-GFP)、实验组(pAdxsi-CerS2-GFP)细胞总RNA与总蛋白,实时荧光定量聚合酶链反应(Q-PCR)、蛋白质印迹法(WB)检测各组细胞中CerS2 mRNA、蛋白表达水平;3)噻唑蓝比色法(MTT)检测CerS2基因不同作用时间对各组细胞体外增殖的影响;4)流式细胞术PI法分析各组细胞周期变化;5)Annexin V-APC/7-AAD双染法检测各组细胞凋亡。结果:1)经酶切、测序鉴定,克隆片段大小、序列与NM022075一致,其感染BCPAP细胞最佳MOI值为240,最佳作用时间48h;2)Q-PCR、WB结果提示实验组细胞CerS2 mRNA在24h、48h、72h相对表达量依次为空白组/空载组的134.57倍、774.26倍、347.29倍(均P<0.001),其蛋白48h表达水平也较空白组、空载组明显增加(P<0.01),空白组与空载组CerS2 mRNA相对表达量、蛋白表达水平均无明显统计学差异(P>0.05);3)MTT法检测生长曲线发现:24h、48h实验组相对空载组、空白组,细胞OD值明显降低(均P<0.001),空白组与空载组比较细胞OD值无明显统计学差异(P>0.05);4)流式细胞术检测三组细胞周期,结果提示:空白组与空载组细胞周期时相分布无统计学差异(P>0.05);G0/G1期、S期实验组细胞数分别为(40.38±3.43)%、(18.83±1.18)%,空载组细胞数分别为(56.63±1.95)%、(27.28±0.52)%,实验组较空载组G0/G1期、S期细胞数下降(均P<0.01),实验组G2/M期细胞数(40.79±4.50)%较空载组(16.09±1.44)%明显增高(P<0.001);5)流式细胞术检测空载组细胞凋亡率相对空白组无明显统计学差异(P>0.05),实验组细胞凋亡率(29.64±0.20)%较空白组(5.70±0.19)%、空载组(6.07±0.17)%明显增高(均P<0.001)。结论:本研究采用pAdxsi重组腺病毒骨架载体构建pAdxsi-CerS2-GFP人源重组腺病毒表达载体,成功感染甲状腺癌BCPAP细胞,并分别从mRNA、蛋白层次验证BCPAP细胞CerS2基因过表达成功。研究结果显示CerS2基因过表达对BCPAP细胞增殖有抑制作用,其主要机制可能与导致BCPAP细胞G2/M期阻滞,进而诱导细胞凋亡发生有关,继续深入研究其作用机制,可望为甲状腺癌的临床诊治及基础研究提供依据。
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