白背飞虱内共生真菌多样性及对杀真菌剂的敏感性研究

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昆虫内共生真菌在昆虫生长发育及繁殖过程中发挥重要作用,可以作为有效防治有害昆虫的新靶标。因此全面阐明白背飞虱体内共生真菌的种类、丰度及功能,有利于为进一步研发基于共生关系的防控新技术奠定理论基础。本文以白背飞虱内共生真菌为研究对象,通过ITS扩增子高通量测序技术全面分析了白背飞虱不同发育时期内共生真菌的种类,同时比较了 ITS扩增子高通量测序、变性梯度凝胶电泳、宏基因组等技术对白背飞虱内共生真菌种类鉴别结果的差异;运用宏基因组技术研究了白背飞虱雌成虫内共生真菌代谢通路和功能多样性。检测了杀真菌剂对白背飞虱及内共生真菌的抑制作用,并用荧光定量PCR和离体培养技术检测了白背飞虱不同种类内共生真菌对不同杀真菌剂的敏感性。具体结果如下:(1)采用ITS扩增子高通量测序技术鉴定了白背飞虱不同发育时期共生真菌菌群结构和种类多样性,共注释5个门,15个纲,21个目,31个科,37个属,47个种。其中每个分类阶元丰度最高的菌种为子囊菌门Ascomycota(93.23%-99.91%)、粪壳菌纲 Sordariomycetes(84.02%-99.50%)、肉座菌目 Hypocreales(84.00%-99.50%)、蛇形虫草科 Ophiocordycipitaceae(76.28%-99.18%)、多毛菌属Hirsutella(75.75%-98.69%)、Hirsutella proturicola(75.75%-95.76%)。运用 DGGE 技术对白背飞虱雌成虫共生真菌的多样性进行了检测,共检测出12种真菌,其中11个种在白背飞虱中属第一次描述。比较两种方法鉴定结果发现,共同鉴定出来内共生真菌仅一种 Cladosporium halotolerans。(2)基于宏基因组技术对白背飞虱雌成虫共生真菌物种注释、功能基因分析可得,共生真菌物种共注释11个门、31个纲、65个目、127个科、205个属和323个种。与ITS扩增子物种注释结果比较,共同鉴定出来属有13个。比较物种丰度,ITS扩增子结果显示只有Hirsutella proturicola丰度较高,但是宏基因组的结果显示有两个种高于 10%,分别为Hirsutella minnesotensis(20.68%)和Ophiocordyceps sinensis(11.54%)。(3)使用KEGG数据库注释得到的结果显示,功能基因注释到最多的代谢通路为Metabolism(新陈代谢)包含3294条Unigens,主要分布在碳水化合物代谢(Carbohydrate metabolism)、全局(Overview)和氨基酸代谢(Amino acid metabolism)。使用eggNOG数据库对其注释结果显示,其基因数目注释最多的是功能未知(Function unkown),其次是翻译后修饰、蛋白质周转、伴侣、翻译(Posttranslational modification,protein turnover,chaperones,translation),核糖体结构与生物发生(Ribosomal structure and biogenesis)。最少的是细胞运动(Cell motility)和核结构(Nuclear structure)。使用CAZY数据库注释得到的结果显示其基因数目注释多的是糖基转移酶(Glycosyl transferases),其次是糖苷水解酶(Glycosidehydrolases)。注释到最少的功能基因是碳水化合物酯酶(Carbohydrate esterases)。(4)测定了五种杀真菌剂70%丙森锌可湿性粉剂(PR),70%霜霉威盐酸盐水剂(PH),75%肟菌酯&戊唑醇水分散粒剂(TT),40%嘧霉胺悬浮剂(PY)和50%异菌脲悬浮剂(IP)对白背飞虱若虫、雌成虫死亡率及其体内共生真菌数量的影响。初步筛选出对白背飞虱体内共生真菌抑制作用明显的杀真菌剂是50%异菌脲悬浮剂。用qPCR测定了五种杀真菌剂处理后白背飞虱体内两种共生真菌(Ascomycetes symbiotes 和 Cla-like symbiotes)的丰度。结果显示,共生真菌Ascomycetes symbiotes的丰度在IP、PY和PR处理后明显降低,IP处理的抑制效果最强(F=6.825,df=5,12,p=0.003);同时IP处理对于Cla-like symbiotes的抑制效果明显。IP处理的白背飞虱雌成虫生存率仅为42.22%。(5)体外培养获得一株共生真菌,通过18S-ITS rDNA序列分子鉴定,发现其与Moesziomyces antarcticus序列比对结果为 1 00%,因此命名为Moe-likesymbiotes;同时测定其生长曲线,并用抑菌圈实验检测了 Moe-like symbiotes对五种杀真菌剂的敏感性差异。
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