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目的:肌肉萎缩成为一种临床上常见的疾病。女性到一定年龄会出现绝经现象,绝经后人体内雌激素水平急剧下降,肌肉质量和强度的下降对人体生理功能产生一系列负面影响,增加了患多种疾病的风险。骨骼肌是运动系统的动力部分,在神经驱使下,进行正常的收缩,关节作为枢纽,牵动骨活动。肌肉萎缩疾病严重影响绝经女性的日常生活,而科学的体育运动则可以预防肌肉萎缩,并且对肌肉质量、面积、肌力都有良好的改善作用,有针对性的运动方式对骨骼肌有更加积极影响,如抗阻力运动中的一种方式负重运动。低强度脉冲超声(LIPUS)是近几年作为一种被公认的无创伤、安全可靠的治疗工具被广泛运用于损伤部位和骨折愈合的治疗中。作为一种机械刺激,促进细胞增殖与存活,对软组织及骨骼肌的影响而备受关注,其探究空间和价值甚高。采用运动和低强度脉冲超声双重干预手段在预防和治疗肌肉萎缩相关领域研究匮乏。因此本实验建立切除大鼠双侧卵巢模型,采用负重运动和低强度脉冲超声以及二者联合干预手段,从基因、蛋白、组织学、病理学等角度去研究不同干预手段对切除卵巢大鼠股四头肌的影响以及相关机制研究。在细胞层面通过研究四点弯曲力学加载仪模拟运动和低强度脉冲超声两种手段干预对成肌细胞的影响以及相关机制研究。探索预防和治疗绝经后雌激素不足导致的肌肉萎缩疾病的有效方法,为临床方面的应用提供理论依据。方法:本研究的实验对象为体重在220-240 g健康纯系雌性SD(Sprague-Dawley)大鼠70只。随机分为假性手术组(Sham Operation,Sham),卵巢切除组(Ovariectomized group,OVX),伤口愈合2w后,将卵巢切除组(OVX)随机分为卵巢切除对照组(Ovariectomized group,OVX),卵巢切除负重运动组(Ovariectomized+Weight-bearing exercise group,O+W)和卵巢切除超声治疗组(Ovariectomized+Ultrasound group,O+U)。负重运动与超声联合治疗组(Ovariectomized+Weight-bearing exercise and ultrasound group,O+W+U)。雌性大鼠承受的重量约为大鼠自身体重的35%,让大鼠进行适应性运动1 w后接着进行正式跑台运动,跑台速率设置为20 m/min,每组时间为30 min,负重运动总周期为10 w,每周运动6 d。10 w负重运动后从Sham、OVX和O+W组中随机取8只大鼠,留存血清和组织待后测。10 w负重运动结束后接着进行3 w的超声诊治,剩余大鼠超声治疗组和负重超声联合组则使用LIPUS仪进行超声诊治,超声治疗仪强度为30 mW/cm2,中心频率1.5 MHz,占空比为20%,治疗时间20 min,每周治疗6 d,持续3 w超声治疗。最后检测各组大鼠血清和组织CK和LDH等生化指标,使用H&E染色法对大鼠股四头肌进行形态学方面的分析。运用RT-qPCR和WesternBlot从基因水平和蛋白水平对MSTN/Akt通路上的各关键信号分子分析,探讨负重运动和低强度脉冲超声对卵巢切除大鼠股四头肌的影响以及生物学机制。为了进一步探寻运动和低强度脉冲超声对骨骼肌的影响,本实验在细胞方面做了进一步研究,四点弯曲力学加载仪干预成肌细胞增殖分组:细胞随机进行分组,分为对照组(Control)和牵拉刺激组(strain,ST),牵拉刺激组参数设置为:频率均为 0.5 Hz,加力 60 min,分别牵拉应力 1000 μstrain、2000 μstrain、4000 μstrain的机械信号刺激。牵拉干预完成后,观察细胞形状、分布情况。24 h后用CCK-8试剂盒检测细胞活性和进行蛋白提取。低强度脉冲超声仪器干预成肌细胞增殖分组:细胞随机进行分组:对照组和LIPUS组,LIPUS参数设置为:中心频率为1.5 MHz,刺激强度为30mW/cm2,占空比为20%,时间为20 min/d,连续干预24h、72 h、120 h。第二天用CCK-8试剂盒检测细胞活性和进行蛋白提取,具体步骤按照试剂盒说明书进行操作,最后得出所需数据并分析。Western Blot方法检测MSTN及其上游调控信号分子的表达情况。结果:1.根据大鼠体重、抓力、股四头肌湿重和子宫湿重结果显示:与Sham组相比,OVX组大鼠体重增加,且存在极显著差异(P<0.01),大鼠抓力降低且存在极显著差异(P<0.01),大鼠股四头肌和子宫湿重也显著降低,且存在极显著差异(P<0.01,P<0.01);通过10 w负重运动后,O+W组大鼠体重有所下降,有显著差异(P<0.05),大鼠抓力、大鼠股四头肌湿重有所增加,且存在极显著差异(P<0.01,P<0.01);LIPUS治疗3 w后,与OVX组相比O+W、O+W+U组大鼠体重显著降低(P<0.01,P<0.01),O+W、O+U、O+W+U 组大鼠抓力显著增加(P<0.05,P<0.01,P<0.05),大鼠股四头肌湿重显著增加(P<0.01),子宫湿重没有明显变化。2.根据大鼠血清和组织生化指标检测结果显示,通过10 w负重运动,与Sham组对比,OVX组的CK和LDH活性显著上升,且有极显著性差异(P<0.01,P<0.01);与OVX组对比,O+W组的CK、LDH活性有极显著差异(P<0.01,P<0.01)。3 w低强度脉冲超声治疗后,OVX组、O+W组、O+U组、O+W+U组大鼠血清中CK活性和LDH活性与Sham组大鼠相比,有极显著变化(P<0.01),与OVX组相比O+W、O+U、O+W+U组CK和LDH活性显著性下降,O+W+U组中大鼠的CK和LDH活性下降最为明显。3.通过H&E染色方法对大鼠股四头肌形态学指标检测结果显示,10 w负重运动预防时期,与Sham组对比,OVX、O+W组肌纤维平均横截面积都有所减少并存在极显著差异(P<0.01,P<0.01);与OVX组对比,O+W组大鼠股四头肌肌纤维横截面积有所升高,并存在极显著差异(P<0.01)。LIPUS诊治时期,与Sham组对比,OVX、O+W、O+U和O+W+U组肌纤维平均横截面积都有所减少差异显著(P<0.01,P<0.01,P<0.05,P<0.01);与 OVX 组对比,O+W、O+U 和 O+W+U组大鼠股四头肌肌纤维平均横截面积有所升高,并存在极显著差异(P<0.01,P<0.01,P<0.05);O+U组大鼠股四头肌肌纤维平均横截面积高于O+W组。4.基因和蛋白表达检测结果显示,负重运动和LIPUS明显抑制了 MSTN mRNA表达水平及其受体ActRIIB mRNA和ActRIIB蛋白表达水平,明显上调了大鼠肌肉中重要分子Akt mRNA、mTOR mRNA和mTOR、Akt及其磷酸化p-Akt蛋白表达水平和下游信号分子FoxO1 mRNA表达和FoxO1蛋白表达水平。5.从细胞实验结果可以得出,四点弯曲机械牵拉和低强度脉冲超声干预成肌细胞,通过CCK-8检测细胞增殖情况,与Control组相比,四点弯曲机械牵拉组和低强度脉冲超声组成肌细胞都出现明显的增殖情况,且存在显著性差异,其中2000μstrain和LIPUS-72 h组增殖效果最为明显,采用Western Blot方法,提取成肌细胞做蛋白检测,四点弯曲机械牵拉和低强度脉冲超声干预成肌细胞后,明显抑制了 MSTN的蛋白表达,上调了 ERK1/2、Integrin蛋白表达水平,且有显著性差异。也说明四点弯曲机械牵拉模拟运动和低强度脉冲超声双重干预手段在干预成肌细胞中参数为2000 μstrain和LIPUS-72 h为最佳参数。结论:1.负重运动可以有效预防去卵巢导致的大鼠骨骼肌萎缩,有效增加了股四头肌肌细胞横截面积,这一良好效应在不施加运动训练的超声治疗3 w期间无明显改变。2.负重运动和低强度脉冲超声干预以及二者联合干预对切除卵巢大鼠股四头肌萎缩出现的肌肉萎缩有良好的改善作用。3.负重运动和低强度脉冲超声联合对去卵巢大鼠股四头肌影响的分子机制可能是通过抑制MSTN、受体ActRIIB的表达以及激活下游Akt、mTOR、FoxO1促进蛋白质合成,抑制其降解,从而改善肌肉萎缩。4.细胞实验显示,四点弯曲和低强度脉冲超声均可促进成肌细胞增殖,并且Integrin β1/ERK1/2可能是调控MSNT表达的上游信号通路。