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胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着人民的生命健康。由于肿瘤在临床上具有异质性,通常情况下,具有组织学类似肿瘤的患者具有不同的临床病程,且是由于癌瘤间的分子差异所致。根据胃癌患者的病情严重程度,定制个性化的治疗方案,将改善患者的结局,并有助于使那些不可能受益的患者免于不必要的花费和副作用的产生。肿瘤生物标志物主要分为血清肿瘤标志物和细胞肿瘤标志物两大类,反映肿瘤的发生发展。关于胃癌,目前尚无特异性的血清肿瘤标志物,而细胞肿瘤标志物绝大多数还处于研究观察阶段,因此筛选有效的判断胃癌阶段的生物标志物,并探究其在胃癌病程进展中的变化,从而指示胃癌的病情严重程度,指导临床治疗方案的制定,具有重要的临床意义。本研究主要包括以下两个部分:第一部分胃癌血清标志物的筛选及评分系统的确定目的:研究血清肿瘤标志物评分与胃癌进展、临床分期之间的关系。方法:检测708例胃癌患者初诊时血清肿瘤标志物(CEA、CA19-9、CA125)水平,将肿瘤标志物测量值除以参考范围临界值得到测量值/参考值比值(Test value/Reference cut off value Ratio,TRR),计算每例患者三个指标(CEA、CA19-9、CA125))对应的TRR。根据相关参考文献,将TRR分成了四部分,每一部分分别对应一个分值,得到TRRS(TRRscore),即TRRS0对应TRR<1.00,TRRS1 对应 1.00<TRR ≤ 3.00,TRRS2 对应 3.00<TRR ≤ 6.00,TRRS3 对应TRR>6.00。将三个肿瘤标志物的TRRS相加,得到一个总和,即肿瘤标志物评分系统(Tumor Marker panel Scoring System,TMSS)。分析 TRRS 与胃癌患者临床病理特点、临床分期之间的关系,试图通过确定TMSS,阐明肿瘤标志物升高倍数与胃癌临床分期的量化关系。结果:CEA、CA19-9、CA125的TRR随着临床分期(TNM分期)的升高而显著增大,TRRS与肿瘤浸润深度、淋巴结转移状态、远处转移、临床分期呈显著正相关。将TRRS相加后,一种新型的肿瘤标志物评分系统TMSS被提出并赋予了其不同的意义:TMSS阴性(Negative TMSS,TMSS = 0,n = 401),代表三种肿瘤标志物(CEA、CA19-9、CA125)水平均正常;TMSS低水平(Low TMSS,1≤TMSS≤3,n = 211),表示至少有一种肿瘤标志物升高;TMSS中水平(Middle TMSS,4≤TMSS≤6,n = 81),表示至少有两种肿瘤标志物升高;TMSS高水平(High TMSS,7≤TMSS≤9,n=15),表示患者三个肿瘤标志物均升高。TMSS与胃癌患者临床分期之间存在显著的正相关,TNM分期越晚,Middle TMSS和High TMSS的比例就越大,High TMSS的胃癌患者均处于晚期(Ⅲ期或者Ⅳ期)。结论:CEA、CA19-9和CA125 TRRS是初入院胃癌患者疾病进展的有效指标,TMSS可以用于胃癌患者临床分期的评估,尤其是在晚期胃癌患者中的预测价值更大,High TMSS的胃癌患者均处于晚期(Ⅲ期或者Ⅳ期)。第二部分基于巨噬细胞的胃癌新型生物标志物的探索目的:探索巨噬细胞在胃癌组织中的浸润情况及其临床意义,探索巨噬细胞在胃癌病程进展中的动态变化过程,为临床上及时准确的判断胃癌的病情变化提供新的分子标记。方法:通过Oncomine数据库分析巨噬细胞标记CD68在胃癌组织和正常组织中的表达差异,免疫组化检测CD68在癌旁组织和胃癌组织中的表达差异,并进行细胞计数,比较早晚期胃癌组织中巨噬细胞浸润数目有无差异。Kaplan Meier Plotter数据库分析巨噬细胞浸润密度在早晚期胃癌患者中的预后意义。将THP-1诱导的巨噬细胞与不同比例的胃癌细胞共培养后,倒置显微镜下观察巨噬细胞的形态变化,RT-PCR法检测巨噬细胞相关基因mRNA的表达,Western blot检测巨噬细胞蛋白的表达,流式检测巨噬细胞凋亡情况。进一步,建立不同大小胃癌皮下移植瘤动物模型,提取其腹腔巨噬细胞,多种方法鉴定后,运用RT-PCR法检测腹腔巨噬细胞相关基因mRNA的表达水平,并分析其表达与皮下瘤体积的相关性。结果:胃癌组织中巨噬细胞浸润增多,但是在早期(Ⅰ期+Ⅱ期)和晚期(Ⅲ期+Ⅳ期)胃癌组织中巨噬细胞的数目无明显的差异。巨噬细胞高表达与早期胃癌患者预后呈正相关,而与晚期胃癌患者的生存呈负相关性,巨噬细胞对不同分期胃癌患者预后起着不同的指示作用。共培养不同的时间点(12、24、48、72、96小时)后,THP-1来源的巨噬细胞表现出相似的形态、分子标记与细胞因子表达谱,没有明显的时间依赖性。随着共培养组胃癌细胞数量的增大(即胃癌细胞:巨噬细胞比例增大),CD80、TNF的表达逐渐降低,iNOS、IL23及ILlβ的表达部分降低,相对应的,M2型相关基因(CD206、IL10、Clec7a、CD163、TGFβ)表达大部分逐渐上升,巨噬细胞逐渐从抗肿瘤Ml型过渡到促进肿瘤的M2型,整体呈现出数量依耐性。裸鼠皮下瘤体积与巨噬细胞相关分子基因表达量的相关性分析显示,Ml型的大部分基因的表达与肿瘤体积呈负相关,M2型的大部分基因的表达与肿瘤体积呈正相关。结论:胃癌组织中巨噬细胞浸润增多,但在早期和晚期胃癌组织中其数目无明显的差异,巨噬细胞浸润密度对早晚期胃癌患者的预后意义不同,可能与巨噬细胞的分型有关;在胃癌进展中,随着肿瘤体积的增大,巨噬细胞逐渐从抗肿瘤效应的M1型过渡到免疫抑制的M2型,其M1型大部分基因的表达与肿瘤大小呈负相关,M2型大部分基因的表达与肿瘤大小呈正相关;监测巨噬细胞表型的动态变化,可能可以提示胃癌的不同进程。