论文部分内容阅读
目的： 1. 了解2015年1-12月份间分离自温州医科大学附属第一医院临床的肺炎克雷伯菌株的标本来源、科室分布以及对碳青霉烯类药物的耐药情况，为临床治疗肺炎克雷伯菌引起的感染及合理使用抗菌药物提供帮助。 2. 研究肺炎克雷伯菌生物膜形成能力及生物膜形成相关基因，为进一步研究生物膜形成机制提供理论基础。 3. 对携带率最高的Ⅲ型菌毛表达相关基因mrkH进行克隆与表达分析，明确mrkH基因在生物膜形成中的作用，为进一步研究mrkH基因的调控机制打下基础。 方法： 1. 回顾性调查2015年临床分离的309株肺炎克雷伯菌的临床感染分布情况；VITEK 2型全自动微生物分析仪进行常用抗菌药物的敏感性检测。 2. 选择经自动微生物分析仪检测得到的5株亚胺培南耐药菌株和5株亚胺培南敏感菌株，琼脂稀释法测定亚胺培南的最低抑菌浓度（MIC），采用96孔板结晶紫染色法（LB、MHB介质）评估上述10株菌株的生物膜形成能力。 3. PCR扩增Ⅲ型菌毛相关的编码基因（mrkA和mrkD）以及其调控基因（mrkH），观察生物膜形成能力与肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛相关基因的携带情况的关系。 4. 选取一株携带mrkH基因的菌株，PCR扩增mrkH基因片段后，切胶纯化与pGEM-T Easy 质粒载体连接， 通过 Heat Shock 转 化法 得 到 E. coli DH5α-pGEM::pmrkH菌株，电转化法得到FK1911-pGEM::pmrkH菌株，进行PCR验证后进行结晶紫生物膜实验评估生物膜形成能力，进一步研究mrkH基因在生物膜形成中的作用。 结果： 1. 309株肺炎克雷伯菌标本主要来源于痰液，占41.1%（127/309），其次还包括血液18.4%（57/309），脓液10.7%（33/309），尿液9.7%（30/309），引流液5.5%（17/309），创面4.9%（15/309），其它来源占9.7%（30/309）。ICU科室分离的菌株93株，占30.1%（93/309），神经外科及脑外科占7.8%（24/309），创伤及烧伤科科占3.5%（11/309），呼吸内科占1.3%（4/309），神经内科占2.9%（9/309），其它科室共占54.4%（168/309）；肺炎克雷伯菌分离株中有61株对碳青霉烯类药物耐药，耐药率19.7%（61/309）。其中对亚胺培南耐药的共有59株，耐药率19.1%（59/309）；对厄他培南耐药的共有60株，耐药率19.4%（60/309）。 2. 琼脂稀释法所测得10株菌对亚胺培南的MIC值与全自动微生物分析仪测定的药物敏感性结果相符。不同介质下的生物膜实验显示耐药组和敏感组之间的生物膜形成能力没有明显差异，但各菌株间差异明显。 3. PCR扩增结果显示10株菌株样本均携带有mrkA基因和mrkD基因。3株生物膜形成能力微弱的菌株未检测出mrkH基因，其余7株较强生物膜形成能力的菌株均检测到mrkH基因。 4. 转化入mrkH基因的FK1911-pGEM::pmrkH菌株的生物膜形成能力明显强于不含有mrkH基因的FK1911野生型菌株。 结论： 1. 本院分离的肺炎克雷伯菌的标本来源主要是痰液，病区分布以ICU为主；肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物产生严重的耐药，耐药率达到19.7%。 2. 肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药组与敏感组之间的生物膜形成能力没有明显差异，但各菌株间的生物膜形成能力强弱不一，表明生物膜的形成与是否对碳青霉烯类药物耐药无关。 3. 10株肺炎克雷伯菌都携带mrkA和mrkD基因，而生物膜形成能力强的都携带mrkH基因，生物膜形成能力弱的不携带mrkH基因，提示肺炎克雷伯菌生物膜形成能力与mrkH的关系比编码Ⅲ型菌毛的mrkABCDEF操纵子更加密切。 4. 未携带mrkH基因的肺炎克雷伯菌菌株通过电转化携带pGEM::pmrkH质粒DNA后，相比之前的生物膜形成能力有了极大的提高，说明mrkH基因对生物膜的形成起到重要的调控作用。