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在酵母中,染色体沉默因子Sir2(silent information regulator-2)是NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶,它参与了基因组稳定和衰老等多种生理过程[1-2]。Sir2在哺乳动物中有七个家族成员(SIRT1-SIRT7)[3]。近年来,大量研究表明Sirtuin家族成员广泛参与凋亡,应激,分化,衰老,基因表达等多种生理过程[4]。SIRT7是这个家族中唯一定位于细胞核仁的蛋白[5]。也是到目前为止,唯一没有被鉴定出酶活性的家族成员。SIRT7是Poll聚合酶的活化子,能够促进rDNA转录。研究表明在乳腺癌和甲状腺癌中SIRT7mRNA高表达,提示SIRT7可能参与癌症的发生过程。因此研究SIRT7基因的表达调控机制对于我们了解SIRT7在肿瘤发生,应激等生理过程中的作用具有重要意义。本文主要研究了SIRT7的启动子和SIRT7蛋白稳定性调控机制,以及SIRT7在细胞中的亚细胞定位,并尝试鉴定了SIRT7的组蛋白与非组蛋白的去乙酰化酶活性。1SIRT7mRNA的表达谱我们通过Northern blotting和RT-PCR在mRNA水平检测了SIRT7在小鼠主要组织和几种人源细胞系中的表达,结果显示SIRT7在小鼠组织中广泛表达,其中在肝脏组织中表达最为丰富。在人胚肾细胞HEK293T, MCF7, Huh7, HepG2, HeLa细胞中SIRT7均有表达,在肺癌细胞H1299中几乎不表达。25’-RACE确定SIRT7转录起始位点提取小鼠肝脏和人急性白血病细胞HL60RNA,利用SIRT7特异引物以及5’-RACE连接子内外引物进行巢式PCR,得到长度为650bp的扩增产物,结果显示SIRT7基因在人和鼠中存在单一的转录起始位点。转录起始位点为C碱基,转录起始位点上游没有典型的TATA box和GC box,也没有明显的CpG岛。3克隆并鉴定SIRT7启动子区我们首次克隆并鉴定了SIRT7启动子区。实验结果表明SIRT7的转录起始位点到上游-2Kb的DNA片段具有启动子活性,并且这种启动子活性具有细胞特异性。通过启动子删切实验表明,-312/-174的DNA片段为SIRT7启动子的关键区域。通过生物信息学的方法确定该区域含有保守的C/EBPα转录因子结合位点。4Doxorubicin能够影响SIRT7蛋白稳定性, SIRT7蛋白稳定性受泛素蛋白酶体途径调控.我们发现在DNA损伤过程中,MCF7细胞内SIRT7蛋白水平快速下降。而SIRT7mRNA水平却不下降。表明SIRT7蛋白调控过程发生于转录后水平。外源表达的SIRT7蛋白和内源的SIRT7蛋白具有较短的半衰期,其稳定性受泛素蛋白酶体的调控。体内泛素化实验表明,SIRT7在细胞内能够发生多聚泛素化。5SIRT7在细胞内的亚细胞定位.免疫荧光显示在HEK293T细胞和MCF7细胞和Huh7细胞中,外源表达的Flag-SIRT7并不定位于核仁,而是分布在细胞核内,并且在核膜内侧富集。在细胞分裂期,Flag-SIRT7不与染色体结合。而全长的人源EGFP-SIRT7却主要定位在核仁,在有丝分裂期,EGFP-SIRT7与染色体紧密结合。结果表明外源表达的SIRT7蛋白在细胞内的定位依赖于表达量和融合标签类型。鉴于商业化SIRT7抗体特异性差,我们首次生产了识别小鼠SIRT7蛋白362-379位氨基酸的多克隆抗体,并证明了SIRT7多克隆抗体的特异性。使用SIRT7多克隆抗体,通过免疫荧光法,发现内源SIRT7在HEK293T, Huh7, MCF7细胞内以点状分布于细胞核,并且分布区域DAPI染色较浅。6尝试鉴定SIRT7的去乙酰化酶的活性我们纯化原核表达的GST融合的SIRT7蛋白,在体外建立组蛋白去乙酰化反应体系。结果表明原核表达的SIRT7没有组蛋白H4K16的去乙酰化的活性。用免疫荧光法发现在MCF7细胞内,外源表达的SIRT7没有H3K9Ac, H3K14Ac, H4K5AC, H4K8AC, H4K12Ac, H4K16Ac和P53的去乙酰化酶活性。