论文部分内容阅读
本研究借助高通量测序技术对正常生理状态和嗜水气单胞菌感染后的中华绒螯蟹血细胞转录组进行了分析,筛选获得了一些与免疫相关基因序列;在此基础上,采用双分子荧光互补技术(BiFC)分析了中华绒鳌蟹细胞粘附蛋白(Peroxinectin)与整合素(Integrin)、CuZn-SOD的相互作用关系;通过实时荧光定量PCR技术检测了Cd2+胁迫条件下中华绒螯蟹免疫相关基因表达变化规律,同时运用组织切片技术分析Cd2+胁迫后,中华绒螯蟹鳃组织形态结构差异变化。结果发现:1、经Illumina双端测序,在对照组和感染组的转录组中共获得63.85×106和64.91×106条原始序列(raw reads);将原始数据去除接头、不确定碱基和低质量的序列后得到47.85×106和48.36×106条clean reads,测序数据总产出超过5G;经从头拼接共得到组了93328条转录本和78731条Unigene序列,拼接后转录本和Unigene平均长度分别为723 bp和637bp;2、在去除短序列和重复序列之后,将93328条和78731条非冗余转录本和Unigene与Pfam、String、Swissprot、KEGG、NR数据库中已知序列进行比对发现,转录本注释百分比分别为15.79%、5.10%、20.08%、15.53%和28.29%;Unigene注释百分比分别为13.19%、4.37%、17.90%、14.08%和25.92%;3、共有6233条转录本和5068条Unigens获得了GO注释信息,归到26个COG类别中,45条转录本和37条Unigenes被注释为免疫系统过程,797条转录本和21条Unigenes被注释为应激反应及50条和44条转录本和Unigenes被注释为抗氧化活性;KEGG分析发现,709条转录本和519条Unigenes参与免疫系统途径,306条转录本和240条Ungenes与环境适应途径相关;进一步通过人工初步筛选,共获得了158个与免疫相关的基因;4、通过对中华绒螯蟹对照组和感染组的转录组进行差异表达分析,结果发现1683个显著性差异表达基因,与对照组相比,有1450个DEG呈上调模式,233个DEG呈下调模式;SNP分析发现,转录组中共有38370个和36127个高质量的SNP位点,在对照组转录组中,平均560bp出现一个SNP,感染组转录组中,平均530bp出现一个SNP;5、BiFC系统检测发现,中华绒螯蟹血细胞中的细胞黏附蛋白(Peroxinectin)能在真核细胞内与整合素(Integrin)、CuZn-SOD结合;同时,以嗜水气单胞杆菌感染中华绒螯蟹后,与对照组相比,PXN、Integrin、CuZn-SOD的mRNA均表现为显著性降低(P<0.05)。6、通过qRT-PCR技术分析不同浓度Cd2+(分别为0.05、0.1、0.25 mg/L)胁迫对中华绒螯蟹免疫相关基因酚氧化酶原激活因子(PPAF)、脂多糖和β-1,3-葡聚糖结合蛋白(LGBP)、Dorsal、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、细胞黏附蛋白(PXN)、整合素(Integrin)表达的影响,结果发现,与对照组相比,Cd2+胁迫组中7种免疫相关基因表达量均发生显著变化(P<0.05),且不同基因的表达模式各不同相同。7、组织切片技术分析发现,不同Cd2+浓度胁迫中华绒螯蟹后,鳃丝结构的完整程度下降;随着Cd2+浓度的倍数增加,鳃丝中间部分厚度基本呈现为递增趋势。