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研究背景及目的:足细胞损伤及功能异常是肾小球疾病发生及慢性肾脏病进展的主要发病机制。足细胞是终末分化、具有高度特异性的肾小球上皮细胞,分化出大量足突贴附于肾小球基底膜外侧,并与肾小球基底膜、血管内皮细胞共同构成肾小球滤过屏障。相邻足细胞足突形成富含蛋白分子复合物的胞间连接称之为裂隙膜(slit diagram,SD)。裂隙膜的“分子筛”作用是滤过屏障选择性通透功能的基础。Nephrin是构成SD区结构的重要分子,通过多种信号通路参与调节足细胞凋亡及细胞骨架。Nephrin胞外段IgG样结构与相邻的Nephrin或Neph1分子相互交联构成SD的结构基础。Nephrin胞内段的酪氨酸残基能被磷酸化,磷酸化的Nephrin能与SD区其他分子如CD2AP、podocin结合参与调控细胞内信号转导。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)可诱导足细胞Nephrin去磷酸化、足突融合和细胞凋亡,但具体机制尚未完全清楚。Src家族激酶(Src family kinases,SFKs)Fyn是磷酸化Nephrin的关键激酶,Fyn基因敲除小鼠出现足细胞Nephrin去磷酸化、足突融合和蛋白尿。C末端Src激酶(C-terminal Src kinase,Csk)磷酸化SFKs激酶Tyr529位点导致后者活性被抑制。Csk通过其SH2/SH3结构域能够与胞膜上的支架蛋白Cbp、paxilln、IRS-1、Caveolin-1结合定位于脂筏,调控下游SFKs活性参与细胞生长、粘附、迁移、极化。Csk可能参与AngⅡ诱导的足细胞Nephrin去磷酸化和细胞损伤。本研究通过建立AngⅡ输注大鼠模型和体外培养足细胞检测Csk的表达及分布改变;通过Csk siRNA转染,分析足细胞Csk低表达对AngⅡ诱导的Nephrin去磷酸化及足细胞损伤的影响,并进一步探讨Csk参与足细胞损伤的分子机制。方法:第一部分:24只SPF级健康雄性Wistar大鼠皮下埋置渗透性微泵,随机分为Ang II输注组和正常对照组,以400 ng·kg-1·min-1 AngⅡ持续输注2周和4周,正常对照组用生理盐水代替AngⅡ。分别于造模前及造模后1w、2w、3W、4w测量各组大鼠尾动脉压,收集24h尿液用于检测尿蛋白含量;分别于造模后2w和4w处死动物,收集肾组织标本,透射电镜观察足细胞超微结构改变;免疫印记检测Csk蛋白表达改变,实时荧光定量PCR法检测肾小球Csk mRNA表达,免疫荧光染色观察Csk/Nephrin在肾小球表达分布;第二部分:体外培养条件永生性小鼠足细胞,随机分为正常对照组、AngⅡ(10-6mol/L)刺激不同时间(1.5、3、6、12、24h)组、AngⅡ不同浓度(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)刺激6h组,收集各组细胞,实时荧光定量PCR、免疫荧光及免疫印记检测CskmRNA、蛋白表达改变;免疫荧光检测Csk表达及其分布变化;免疫印记检测Nephrin磷酸化水平、Fyn激酶pY529磷酸化水平;免疫共沉淀检测Csk与Caveolin-1的相互作用;第三部分:采用Csk特异性小干扰RNA(Csk siRNA)体外转染足细胞,免疫印记检测Csk siRNA转染对AngⅡ诱导的足细胞Csk、磷酸化Nephrin、Fyn pY529、Fyn pY416表达的影响;免疫共沉淀检测Nephrin与pY529、pY416,Csk与Caveolin-1的相互作用;Hoechst-33258及流式细胞术检测测Csk siRNA转染对AngⅡ诱导细胞凋亡的影响;FITC-phalloidin染色标记足细胞F-actin,分析Csk siRNA转染对AngⅡ诱导细胞骨架重构的影响。结果:第一部分:AngⅡ输注组大鼠尾动脉压及尿白蛋白量在相同时间点明显高于正常对照组(P<0.05);透射电镜显示AngⅡ输注组大鼠足细胞出现足突融合甚至消失,伴核质凝集;正常组大鼠肾小球有一定程度的Csk表达,AngⅡ输注组大鼠肾小球Csk表达明显增加(P<0.05),Csk与Nephrin在肾小球内的分布存在一定程度的共定位;第二部分:AngⅡ可诱导足细胞Csk表达增加(P<0.05),Nephrin磷酸化水平降低(P<0.05),Fyn pY529位点磷酸化水平增加(P<0.05),且呈时间、浓度依赖性;免疫沉淀结果显示AngⅡ刺激Csk与脂筏蛋白Caveolin-1相互结合增加。第三部分:Csk siRNA转染足细胞抑制Csk表达,约为非转染组的51%;Csk siRNA转染可以减少AngⅡ诱导的Nephrin与Fyn激酶pY529的结合,并抑制Csk-Caveolin-1复合物的形成;Csk siRNA转染可明显抑制AngⅡ诱导的Fyn激酶磷酸化形式的转化及Nephrin磷酸化改变(P<0.05),并显著改善AngⅡ诱导的足细胞骨架重构和细胞凋亡,与AngⅡ或AngⅡ+Ctl siRNA组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:正常足细胞有一定水平的Csk表达,AngⅡ可诱导足细胞Csk表达增加,并与Caveolin-1相互作用形成Csk-Caveolin-1复合物;AngⅡ可诱导足细胞Fyn激酶活性抑制、Nephrin去磷酸化,Nephrin/Fyn pY529结合增加;干扰Csk表达可影响Csk-Caveolin-1复合物的形成,改善AngⅡ诱导的Fyn活性抑制、Nephrin去磷酸化及足细胞损伤。AngⅡ可能通过Csk-Caveolin-1依赖的方式参与Nephrin磷酸化改变和足细胞损伤。