肺癌已占据全球癌症死亡的首位,发病率和病死率逐年上升,其中非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌总数的80%,其恶性度高,对放疗、化疗不敏感,5年生存率不足15%。研究发现,恶性肿瘤细胞对胆固醇及其前体物质的浓度要求较高,所以限制胆固醇的合成和利用,可作为肿瘤预防和治疗的辅助手段。美伐他汀(mevastatin,M)属HMG-CoA还原酶抑制剂,是甲羟戊酸(mevalonate,MVA,系类异戊二烯的前体)合成途径的限速酶。另外,甲羟戊酸还是除胆固醇外,长醇、泛醌等多种生物合成类异戊二烯化合物的前体。甲羟戊酸衍生物即类异戊二烯类化合物可以影响Ras和Rho蛋白的细胞膜精确定位,它们构成细胞膜的结构并维持其完整性,并参与细胞的增殖、细胞内信号转导和抑制肿瘤细胞侵袭等重要生物学功能[2]。近年来,研究发现美伐他汀可抑制多种恶性肿瘤细胞(如结肠癌细胞、HL-60细胞)的增殖并诱导凋亡,并可以起到抑制肿瘤细胞生长和转移的作用。同时发现,他汀类药物可以增强某些细胞毒药物以及放疗和化疗的抗肿瘤作用,而且并不影响正常组织的功能。迄今为止,他汀类药物这些作用的确切分子机制尚不完全清楚。本研究拟探讨了美伐他汀对NSCLC增殖和侵袭转移能力的抑制作用及其放化疗增敏作用,旨在为美伐他汀的临床应用提供理论依据,为NSCLC的治疗提供新的思路。本实验分为如下四个部分:第一部分:美伐他汀对非小细胞肺癌细胞体外增殖的影响目的:研究美伐他汀对非小细胞肺癌细胞体外增殖的影响和影响机制。方法:1.四唑氮蓝比色试验(MTT)检测美伐他汀对肺腺癌细胞株A549和肺鳞癌细胞株NCI-H520的体外增殖抑制作用。2.流式细胞仪检测美伐他汀对NSCLC细胞周期影响。3.应用RT-PCR方法和流式细胞学检测P21mRNA和蛋白的表达。结果:1.美伐他汀对肺腺癌细胞株A549和肺鳞癌细胞株NCI-H520均有明显的体外增殖抑制作用,IC50值均为50μmol/L,而且随美伐他汀剂量的增大和作用时间的延长,抑制作用明显增强,即有明显的时间和剂量依赖关系。2.随着美伐他汀作用剂量加大,细胞周期发生改变, G0/G1期细胞明显增加,说明美伐他汀可以引起NSCLC细胞周期阻滞。A549和NCI-H520细胞经25-100 ummol/L美伐他汀作用后, G0/G1细胞比例分别为44.46%、68.15%、71.16%和48.48%、70.24%、82.86%,明显高于对照(P<0.05,P<0.01)。3加入外源性甲羟戊酸可完全逆转美伐他汀对A549和NCI-H520细胞株的生长抑制作用和对其细胞周期的影响。4.美伐他汀作用后A549与NCI-H520细胞各组P21 mRNA的表达水平均无明显变化;P21胞膜蛋白进行性下降(P<0.05,P<0.01),成剂量依赖性;而P21总蛋白表达无明显变化(P>0.05)。结论:1.美伐他汀对非小细胞肺癌细胞株有明显的增殖抑制作用,且呈剂量和时间依赖性。2.美伐他汀对非小细胞肺癌细胞的抑制作用与其诱导细胞周期阻滞有关。3.加入外源性MVA可以完全消除美伐他汀对A549、NCI-H520细胞增殖、细胞周期分布的影响,说明美伐他汀对NSCLC细胞增殖的抑制作用是通过抑制甲羟戊酸的合成介导的。4.美伐他汀通过影响ras蛋白的异戊二烯化,即P21蛋白的膜定位,达到抑制NSCLC细胞增殖的作用。第二部分:美伐他汀对非小细胞肺癌细胞凋亡的影响目的:研究美伐他汀对非小细胞肺癌细胞凋亡的影响和影响机制方法:1.应用流式细胞术、丫啶橙双色荧光显微镜和电镜分析检测了美伐他汀对非小细胞肺癌细胞凋亡的影响,2.采用RT-PCR技术分析了美伐他汀作用后凋亡相关因子XIAP、Survivin mRNA的表达3.采用western blot技术分析了美伐他汀作用Survivin蛋白的表达。结果:1.丫啶橙双色荧光染色显示美伐他汀作用于A549和NCI-H520细胞48小时,均出现不同程度的早期凋亡细胞和少量中晚期凋亡细胞(呈现橙色荧光,可见核的断裂和浓缩),而且随美伐他汀剂量的增大,改变越明显。其中晚期凋亡细胞百分率分别为8.17%、21.83%和29.53%和18.58%、21.67%和36.39%,凋亡率显著高于对照组(P<0.05)。2.透射电镜从形态学上证实美伐他汀作用NSCLC细胞后可以出现凋亡的形态学改变:50μmol/L美伐他汀处理A549 48h后,出现早期凋亡细胞的形态的改变:细胞内出现空泡变性,内质网扩张,有出芽现象。100μmol/L美伐他汀处理A549和NCI-H520细胞48h后出现典型的凋亡细胞,表现为外形不规则,体积明显缩小,胞浆浓缩,核碎裂,染色质边缘化、染色质浓集。3.流式细胞仪检测25-100μmol/L美伐他汀作用于A549和NCI-H520细胞后其凋亡率明显增高(P<0.05),呈剂量依赖性。加入外源性甲羟戊酸后A549和NCI-H520细胞凋亡率与对照组比较结果均无显著性差异。4.细胞周期的改变:细胞周期检测亚G1峰发现:随着美伐他汀作用剂量加大A549和NCI-H520细胞亚G1峰越来越明显。5. 50-100μmol/L美伐他汀作用48小时后,NSCLC细胞的survivin mRNA及蛋白的表达逐渐降低,呈剂量依赖性。6. 25-100μmol/L美伐他汀作用24小时后,NSCLC细胞的XIAP mRNA的表达逐渐降低,成剂量依赖性。结论:1.美伐他汀作用NSCLC细胞后可以出现凋亡的形态学及流式细胞学变化,即美伐他汀可以诱导NSCLC细胞发生凋亡。2.美伐他汀诱导NSCLC细胞凋亡的机制可能与降低XIAP、survivin的表达有关。3.加入外源性MVA可以完全消除美伐他汀对A549、NCI-H520细胞凋亡的影响,说明美伐他汀诱导NSCLC细胞凋亡的机制是通过抑制甲羟戊酸的合成介导的。第三部分:美伐他汀对NSCLC细胞体外粘附能力和侵袭力的影响目的:研究美伐他汀对非小细胞肺癌细胞体外粘附能力和侵袭力的影响方法:1应用粘附试验、Transwell法检测美伐他汀对NSCLC细胞株的体外粘附和侵袭能力的影响。2应用western blot方法检测MMP和NF-κB蛋白的表达探讨美伐他汀影响NSCLC细胞株粘附和侵袭能力的机制。结果:1.美伐他汀对A549细胞体外粘附有明显的抑制作用,呈剂量依赖性,即随美伐他汀剂量的增加其粘附率逐渐下降。2.美伐他汀对A549和NCI-H520细胞体外侵袭能力有明显的抑制作用,呈剂量依赖性,即随美伐他汀剂量的增加侵袭抑制作用明显增强。25、50、100μmol/L美伐他汀作用后,A549平均穿膜细胞数分别为123.68、67.20和29.41,NCI-H520平均穿膜细胞数为136.36、58.80和27.97,明显低于对照组和MVA组(P<0.01),随着美伐他汀浓度增高穿膜细胞数减少,且50、100μmol/L组的穿膜细胞数明显低于25μmol/L组(P<0.01)。加入MVA后两组细胞穿膜细胞数接近对照组。3. western blot显示美伐他汀作用A549和NCI-H520细胞后MMP-2、MMP-9、NF-κB(p65)的蛋白表达逐渐降低,呈剂量依赖性。结论:1.美伐他汀可降低NSCLC细胞的体外粘附能力。2.美伐他汀可以抑制NSCLC细胞的体外侵袭能力,3.美伐他汀抑制NSCLC细胞的粘附和体外侵袭能力,其机制可能与减少MMP-9、MMP-2、NF-κB P65蛋白表达有关。第四部分美伐他汀对非小细胞肺癌的放疗和化疗的增敏作用及机制目的:探讨美伐他汀对NSCLC的放疗和化疗增敏作用及其机制。方法:1. MTT法和流式细胞术检测放疗、顺铂(DDP)、足叶乙甙(VP16)单独应用的增殖抑制率及与美伐他汀联合应用的增殖抑制率,并根据金氏公式计算Q值,评价两药的合用效应,检测了美伐他汀对NSCLC的放疗和化疗的影响,2.应用Western印迹法检测p53蛋白在其中发挥的作用,探讨美伐他汀对NSCLC放疗和化疗增敏的作用机制。结果:1. 10Gy放疗联合10-100umol/L美伐他汀作用24-72小时抑制率均显著高于单独放疗组,且随美伐他汀剂量增大、作用时间的延长,抑制率明显增加。2.放疗联合25umol/L美伐他汀作用48小时后,凋亡率分别为41.27%和49.19%,明显高于单独放疗组和美伐他汀组(P<0.01)。3. DDP对肺腺癌、鳞癌细胞株均有明显的体外抑制作用,且抑制作用呈剂量依赖型和时间依赖性。1.25、2.5mg/L的DDP分别联合10-100umol/L美伐他汀后对NSCLC抑制作用明显增强,且两药联合的Q值>1.15,二者合用有协同作用。4. VP16对肺腺癌、鳞癌细胞株均有明显的体外抑制作用,且抑制作用呈剂量依赖型和时间依赖性。1.25、2.5mg/L的VP16分别联合10-100umol/L美伐他汀后对NSCLC抑制作用明显增强,且两药联合的Q值>1.15,二者合用有协同作用。5.美伐他汀联合顺铂作用于A549、NCI-H520细胞后凋亡率明显增加,分别55.27%和42.93%,明显高于单用药组(P<0.01)。6.western blot显示美伐他汀作用A549和NCI-H520细胞后P53蛋白表达逐渐增强,呈剂量依赖性。结论:1美伐他汀可增强DDP、VP16对NSCLC的抑制作用,具有化疗增敏作用,其机制可能与诱导NSCLC细胞凋亡、细胞周期阻滞和上调P53蛋白表达有关。2美伐他汀有放疗增敏作用,其机制可能与诱导NSCLC细胞调亡和上调P53蛋白表达有关。