南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L RNA解旋酶基因功能及印尼产卡拉胶海藻生物多样性分析

来源 :齐鲁工业大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:modlong
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南极地区的气候条件具有终年低温,温度变化大、盐度高的特点,在这种特殊的生存环境下,形成了生物适应低温环境的分子生物学机制与生理生化特性。这就为研究生物的抗低温和耐高盐胁迫基因提供了研究材料。本研究的研究对象是南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-LDEAD-box RNA解旋酶不仅能介导NTP依赖的双链RNA解旋,而且大量的研究表明其在植物的各种非生物胁迫的适应过程中发挥着重要作用。本文从严格嗜冷的南极冰藻 Chlamydomonas sp. ICE-L的EST序列中筛选并克隆得到了DEAD-box RNA解旋酶CiDDX5的全长基因,利用生物信息学软件对该基因编码的蛋白序列进行了研究,并通过实时定量PCR研究了在低温、高盐胁迫下CiDDX5基因表达量的变化。结果显示,DEAD-box RNA解旋酶基因的编码区长2077bp,编码513个氨基酸。在以氨基酸序列构建的系统进化树中,CiDDX5序列和其他绿藻类的聚在一起,与莱茵衣藻,团藻和胶球藻的蛋白序列同源性依次分别为65%,64%和63%。根据南极冰藻ICE-L的cDNA文库的表达序列标签分析(ESTs)的信息得到ICE-L的CiDDX5基因序列,利用Primer Primer5.0软件设计所需特异性引物,选择磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH和核糖体蛋白RLP19这两对基因作为本次实验的参比基因。通过实时定量技术,以在正常生长温度7℃分别培养0h和12h作为对照,放在-20℃分别处理0.5h,1h,3h,6h和12h以及在3倍海水盐度正常光照条件下分别处理0.5、1、3、6和12h,以正常盐度海水培养0小时和12小时作为对照,用通过2-ΔΔCt的计算方法,得出-20℃低温处理以及3倍海水盐度不同处理时间的南极衣藻ICE-L CiDDX5基因的表达变化量。实时定量结果表明,在低温和高盐胁迫下,CiDDX5基因的表达量都有一定程度的提高,提示该基因的功能与南极衣藻适应低温、高盐的海冰环境的特性相关。  本研究从印度尼西亚的蓝梦岛(Lembongan)和帕尼达岛(Nusa Penida)共采集40株产卡拉胶海藻,分别提取各株的基因组DNA、克隆并测序其线粒体Cox2-3间隔序列。依据获取的Cox2-3序列和其它已知种类的cox2-3序列构建系统树,对上述海藻样品的种类进行了匹配鉴定。结果表明,本次共采集到2种产胶藻,齿状麒麟菜(Eucheuma denticulatum)和异枝卡帕藻(Kappaphycus striatum)。本研究为丰富对印尼海域产卡拉胶海藻遗传多样性的认识提供了依据。从红藻中分离出κ-卡拉胶酶产生菌株,并且对实验菌株的产酶发酵条件和培养基进行优化。经过初筛和复筛得到10株高产酶菌株,最高的酶活值为1.18 U/mL。通过单因素试验和正交试验对酶活性菌株的培养条件进行优化。试验确定菌株产酶最佳的培养条件为:在250 mL的三角瓶中75 mL的发酵液装液量、接种量为7%、pH值为8.0、培养温度30℃;培养基的最佳成分为:κ-卡拉胶3 g/L、牛肉膏2 g/L、NaCl20g/L。显著性分析结果显示,NaCl对酶活性的影响显著性最高。
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