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目的多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)是血液系统的第二大恶性肿瘤,随着临床免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂的使用,MM患者的总体生存期得到提高,但最终仍难免耐药复发。骨髓腔缺氧微环境与MM的恶性进展、化疗抵抗及预后不良等密切相关。寻找能够高效杀伤缺氧下骨髓瘤细胞的新型治疗药物是目前MM治疗,尤其是复发难治性MM治疗的关键点。miR-21在几乎所有肿瘤细胞中均为原癌基因,缺氧可以调控其在多种肿瘤中的表达。功能研究揭示miR-21可以通过抑制PDCD4及PTEN等多个肿瘤抑制基因的表达,参与MM侵袭、转移、耐药等恶性行为,因此抑制骨髓瘤细胞中miR-21的表达,可以诱导骨髓瘤细胞凋亡,增强骨髓瘤细胞对化疗药物的敏感性。新藤黄酸是中药藤黄的主要活性成分之一,体内外研究证实其对多种肿瘤均有良好的抗肿瘤特性,具有高效低毒、多靶点、多途径抗肿瘤优势。近年来研究发现,miRNA与中药活性成分抗肿瘤密切相关。本课题旨在明确缺氧下新藤黄酸是否通过miR-21发挥抗MM作用及其可能机制,为进一步临床治疗提供理论及实验依据。方法常氧下新藤黄酸干预MM细胞株U266,CCK8检测细胞增殖抑制率。选取合适的干预时间,予不同浓度的新藤黄酸干预U266细胞,分别置于常氧及缺氧环境中培养,CCK8检测细胞增殖抑制率,AnnexinV-FITC/PI双染后经流式细胞仪(Flow cytometry,FCM)检测细胞凋亡率。U266细胞经不同时间缺氧诱导后,实时荧光定量 PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测细胞miR-21表达变化,Western Blot检测细胞PTEN蛋白表达变化。选取合适的缺氧诱导时间,进一步检测新藤黄酸干预后U266细胞miR-21/PTEN表达。通过脂质体转染miR-21抑制剂,FCM检测细胞凋亡率,qRT-PCR检测细胞miR-21表达变化,Western Blot检测细胞PTEN蛋白表达变化。Western Blot检测缺氧时U266细胞STAT3、p-STAT3及HIF-1 α蛋白表达变化以及新藤黄酸干预对其影响,进一步检测STAT3磷酸化抑制剂、HIF-1 α抑制剂干预对U266细胞miR-21/PTEN表达的影响。建立裸鼠移植瘤模型,观察U266细胞成瘤性,分别设立生理盐水对照组及新藤黄酸实验组(5mg/kg),隔天尾静脉给药,连续两周。记录裸鼠体重及瘤体生长情况,两周后处死裸鼠,摘取裸鼠心、肝、脾、肺、肾及瘤组织,计算瘤体积和重量变化;组织病理学苏木素-伊红(haematoxylin-eosin,HE)染色检测裸鼠心、肝、脾、肺、肾等主要脏器的病理变化;qRT-PCR检测瘤组织miR-21表达;免疫组织化学染色后检测Ki67和PTEN表达水平,观察新藤黄酸体内抗肿瘤作用。结果CCK8检测结果显示,常氧及缺氧条件下,新藤黄酸对多发性骨髓瘤U266细胞均有较好的增殖抑制作用,且该作用呈浓度依赖性。AnnexinV-FITC/PI双染后经FCM检测结果显示,常氧组中,0、0.8和1.6 μM新藤黄酸干预后,凋亡细胞的比例分别为:4.98±0.34%、9.63±0.99%和19.95±1.39%;缺氧组中,0、0.8和1.6μM新藤黄酸干预后,凋亡细胞的比例分别为:4.49±0.70%、13.01 ±2.04%和 27.50±2.56%。缺氧诱导3、6、12和24小时后,U266细胞miR-21表达量分别是常氧对照组的 1.71±0.14、2.20±0.28、2.26±0.22、2.73±0.23 倍,与常氧对照组比较,差别具有统计学意义(p<0.05);Western Blot结果显示,缺氧诱导后,miR-21下游靶蛋白PTEN表达量降低,与常氧对照组比较,差别具有统计学意义(p<0.05)。予不同浓度新藤黄酸(0、0.1、0.4和1.6 μM)干预U266细胞,分别置于常氧及缺氧条件下培养24h,结果显示,缺氧组中,0.1、0.4和1.6 μM新藤黄酸干预后U266细胞miR-21的表达量分别是缺氧对照组的0.61±0.10、0.42±0.06和0.22±0.04倍,随着药物浓度增加,新藤黄酸对miR-21的抑制作用增加,差别具有统计学意义(p<0.05);常氧组中,0.1μM新藤黄酸干预对miR-21表达量无显著影响,0.4 μM和1.6 μM新藤黄酸干预组miR-21表达量分别是常氧对照组的0.82±0.04和0.44±0.12倍。Western Blot结果显示,缺氧下调PTEN表达,新藤黄酸干预后PTEN表达量随着药物浓度增加而增加(p<0.05)。进一步通过miR-21抑制剂来抑制U266细胞中miR-21的表达,FCM结果显示U266细胞发生凋亡,常氧实验组及缺氧实验组中凋亡细胞的比例分别为:14.93±3.74%和 17.81±2.32%。Western Blot 结果显示,miR-21 抑制剂可明显增加miR-21下游靶蛋白PTEN表达量,与空白转染组相比,差别具有统计学意义（p<0.05)。与常氧组相比,缺氧后U266细胞p-STAT3表达增多,HIF-1 α蛋白表达上调。缺氧下新藤黄酸干预能够显著抑制STAT3磷酸化,下调HIF-1 α蛋白表达。与单纯缺氧组相比,STAT3磷酸化抑制剂S3I-201、HIF-1 α抑制剂2-ME分别干预缺氧U266细胞后,miR-21表达显著下降,其下游靶蛋白PTEN表达显著增加,差别具有统计学意义(p<0.05)。裸鼠体内实验结果显示,治疗期间对照组瘤体积增长率显著高于用药组(p<0.05),治疗前后裸鼠体重无明显变化(p>0.05)。组织病理学HE染色检测显示,新藤黄酸治疗组与生理盐水对照组相比,对裸鼠主要脏器没有造成显著的组织结构和细胞形态的病理变化。qRT-PCR检测结果显示,与对照组相比,新藤黄酸治疗组瘤组织miR-21表达量显著降低。免疫组织化学染色显示新藤黄酸治疗组Ki67表达较对照组明显下降,PTEN表达明显增加。结论缺氧能够诱导U266细胞株miR-21表达增加,降低其下游靶蛋白PTEN蛋白表达。缺氧下新藤黄酸通过抑制U266细胞STAT3磷酸化以及HIF-1 α蛋白表达来调控miR-21/PTEN的表达,从而发挥抗骨髓瘤作用。体内外实验结果表明,新藤黄酸对缺氧下MM细胞也有较好的肿瘤抑制作用,有望成为MM治疗的新药。