第一部分DKK1在多发性骨髓瘤中的临床研究目的研究MM患者骨髓上清液及血清Dickkopf1(DKK1)水平,及其与骨髓瘤分期、溶骨性病变的关系,以及不同化疗方案对DKK1的影响及与疗效的关系,探讨DKK1在多发性骨髓瘤中的临床作用。方法采用双抗体夹心酶标免疫分析法(ELISA)检测80例初诊MM患者、10例MGUS患者及20例对照骨髓上清液及血清DKK1水平,以及检测136例接受硼替佐米+地塞米松或沙利度胺+地塞米松治疗的MM患者化疗前后血清DKK1水平。结果MM患者与MGUS患者相比,骨髓上清液DKK1水平明显增高(9.3588ng/ml vs 1.7620ng/ml,P=0.001)。而MGUS患者与对照组相比,DKK1水平无明显变化(1.7620ng/ml vs 1.2491ng/ml,P>0.05)。骨髓上清液组与血清组之间DKK1水平无统计学差异(9.3588ng/ml vs 9.2437ng/ml,P>0.05)。DKK1水平与骨髓瘤分期(Durie and Salmon分期)相关,II期和III期MM患者骨髓上清液DKK1水平明显高于I期患者(I期2.4410ng/ml vs II、III期10.3471ng/ml,P=0.002)。I期MM患者与MGUS患者骨髓上清液DKK1水平无统计学差异(P>0.05)。使用ISS分期也得到相似结果。重要的是,有溶骨性病变的MM患者骨髓上清液DKK1水平明显高于没有溶骨性病变的患者(11.2272ng/ml vs 2.4348ng/ml,P<0.001)。而且骨髓上清液DKK1水平还与骨损害的病灶数相关(0,1-3,>3,分别为2.4348ng/ml,4.9845ng/ml,15.3342ng/ml,P<0.001)。沙利度胺+地塞米松(TD)组患者化疗前后血清DKK1水平无明显变化(10.5614ng/ml vs 9.5326ng/ml,P>0.05)。硼替佐米+地塞米松(VD)组患者化疗前后血清DKK1水平明显下降(14.1789ng/ml vs8.3972ng/ml,P<0.05)。所有化疗有效(CR+PR)MM患者,化疗前后血清DKK1水平明显下降(11.6838ng/ml vs 7.1931ng/ml,P<0.05);而化疗无效(NC+PD)者,则血清DKK1水平无明显变化(14.0947ng/ml vs 12.1185ng/ml,P>0.05)。在TD组,无论是化疗有效还是无效,化疗前后血清DKK1水平均无明显变化(P>0.05)。VD组化疗有效者,化疗前后血清DKK1水平显著下降(13.3492ng/ml vs 5.9769ng/ml,P<0.01)。VD组化疗无效者,化疗前后血清DKK1水平有所下降,但无统计学差异(16.0644ng/ml vs 13.8978ng/ml ,P>0.05)。结论MM患者DKK1水平明显高于MGUS患者及对照组,而且DKK1水平与骨髓瘤分期及溶骨性病变密切相关,能反映溶骨性病变的程度和范围。DKK1水平在化疗有效时明显下降,但与化疗方案有关,硼替佐米能使DKK1水平明显下降,而沙利度胺及地塞米松却无此作用。第二部分骨髓瘤细胞与基质细胞DKK1相关受体LRP5/6及Kremen1/2基因转录水平的研究目的比较骨髓瘤细胞系、CD138+原代骨髓瘤细胞、MM患者及正常人基质细胞LRP5/6、Kremen1/2及β-catenin mRNA水平,研究骨髓瘤细胞或重组DKK1蛋白对正常人基质细胞上述基因mRNA水平的影响,以探讨DKK1在多发性骨髓瘤中的作用。方法采用Western blot及ELISA方法,检测骨髓瘤细胞系、CD138+原代骨髓瘤细胞、骨髓基质细胞及细胞培养液DKK1蛋白表达情况,以及Realtime-PCR方法,检测骨髓瘤细胞系、CD138+原代骨髓瘤细胞、MM患者及正常人骨髓基质细胞LRP5/6、Kremen1/2及β-catenin mRNA水平以及骨髓瘤细胞或重组DKK1蛋白与正常人骨髓基质细胞共培养时上述基因mRNA水平。结果骨髓瘤细胞系RPMI-8226、NCI-H929和LP-1以及3/5例MM患者CD138+骨髓瘤细胞,DKK1蛋白表达明显,而4例MM患者基质细胞中未见DKK1蛋白表达,同时DKK1+骨髓瘤细胞培养液中也检测到DKK1蛋白。MM患者基质细胞LRP5/6和Kremen1/2 mRNA水平显著高于正常人基质细胞和CD138+原代骨髓瘤细胞。CD138+原代骨髓瘤细胞β-catenin mRNA水平高于MM患者及正常人基质细胞。无论使用transwell小室或者直接接触法进行骨髓瘤细胞系RPMI-8226、NCI-H929与正常人基质细胞共培养48h及72h,LRP5/6、Kremen1/2 mRNA水平明显增加,β-catenin mRNA水平下降,但24h变化不明显。72h与48h相比,上述基因mRNA水平变化更加明显。重组DKK1蛋白浓度为100ng/ml及300ng/ml时,与基质细胞共培养48h及72h后LRP5/6、Kremen1/2及β-catenin mRNA水平无明显变化。重组DKK1蛋白浓度为500ng/ml时,培养48h LRP5/6 mRNA水平有轻微上升(P>0.05),Kremen1/2 mRNA水平有所上升(P<0.05),及β-catenin mRNA水平略有下降(P>0.05);培养72h LRP5 mRNA水平有所上升(P<0.05),LRP6 mRNA水平无明显变化(P>0.05);Kremen1/2 mRNA水平有所上升(P<0.05),及β-catenin mRNA水平明显下降(P<0.05)。重组DKK1蛋白浓度为700ng/ml时,培养48h及72h LRP5/6、Kremen1/2 mRNA水平明显上升(P<0.05),及β-catenin mRNA水平明显下降(P<0.05)。结论骨髓瘤细胞、MM患者及正常人基质细胞之间LRP5/6、Kremen1/2及β-catenin基因转录水平存在差异,而骨髓瘤细胞分泌的DKK1可能是造成MM患者基质细胞上述基因变化的重要因素。第三部分DKK1的真核表达、纯化及功能测定目的表达和纯化DKK1蛋白,研究骨髓瘤细胞及基质细胞DKK1相关受体表达情况,并探讨DKK1对骨髓瘤细胞及基质细胞效应不同的可能机制。方法利用脂质体介导pcDNA3.1(-)-DKK1质粒瞬时转染293T细胞,使用western blot方法鉴定上清中的表达蛋白,使用Ni-Agrose His标签蛋白纯化试剂盒,纯化融合His标签的DKK1蛋白。利用流式细胞术(FCM),对CD138+骨髓瘤细胞、MM患者基质细胞及健康志愿者基质细胞表面DKK1相关受体表达情况进行同步分析比较。结果使用脂质体转染法,成功将pcDNA3.1(-)-DKK1质粒瞬时转染293T细胞,获得表达蛋白。使用特异性抗Dkk1抗体与小鼠抗6×His单克隆抗体行Western Blot鉴定重组蛋白,证实重组蛋白是融和了His标签的Dkk1蛋白。流式细胞术显示,重组DKK1蛋白能与CD138+骨髓瘤细胞、MM患者基质细胞及健康志愿者基质细胞特异性结合。其中健康志愿者基质细胞平均荧光强度(MFI)为20.8±8.4;CD138+骨髓瘤细胞MFI为58.6±17.2;MM患者基质细胞MFI为104.5±32.1。三组之间相比有统计学差异(P<0.05)。结论脂质体介导的质粒pcDNA3.1(-)-DKK1体外转染效率较高,能表达有活性的DKK1蛋白,可以与骨髓瘤细胞及基质细胞DKK1相关受体特异性结合。骨髓瘤细胞、基质细胞之间DKK1相关受体蛋白表达量不同。