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J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis viruses,ALV-J)是致禽类肿瘤性疾病的病毒。该病毒于1988年首次在肉用型种鸡群中发现,1999年我国在肉鸡中首次分离到ALV-J,此后该病毒一直在我国鸡群中广为流行,对我国家禽养殖业造成巨大的经济损失。p53作为一种抑癌基因,近年来在肿瘤性疾病中的研究非常广泛,并且发现在大多数肿瘤病的发生中p53突变为其关键致病因素,p53逐渐受到人们的关注并成为研究的明星基因。本实验室在前期研究中发现p53突变及过表达与ALV-J的感染致病密切相关。为进一步研究其致病机制,本试验以鸡成纤维细胞系DF-1细胞为模式细胞,运用靶向于鸡p53的CRISPR-Cas9系统双向敲除DF-1细胞,嘌呤霉素筛选阳性克隆细胞,获得敲除p53的DF-1细胞(p53-KO-DF-1)。将ALV-J感染DF-1和p53-KO-DF-1,通过流式细胞术、细胞基因组测序和荧光定量等方法检测p53敲除对ALV-J感染细胞的细胞周期、细胞凋亡和肿瘤相关基因表达的影响。为进一步研究p53突变对ALV-J病毒复制及致瘤机制的影响,我们构建了p53野生型及突变型真核表达质粒,转染p53-KO-DF-1,通过荧光定量、Western Blot和流式细胞术等方法进行系列化研究分析,以揭示p53突变的致病作用。研究取得成果如下:p53敲除系的建立:本研究利用CRISPR-Cas9系统成功构建了p53敲除的DF-1细胞系(p53-KO-DF-1),p53-KO-DF-1为靶向于鸡p53的114位点和629位点的双向敲除。p53抑制ALV-J在DF-1细胞中的复制:ALV-J同时感染野生型DF-1和p53-KO-DF-1细胞。通过荧光定量检测ALV-J pol基因的病毒拷贝数,结果发现ALV-J感染p53-KO-DF-1细胞后48h起,病毒拷贝数显著高于野生型DF-1细胞(p<0.05);ELISA检测细胞上清p27抗原含量的结果同荧光定量结果一致,说明p53抑制病毒复制,进而发挥抑癌作用;通过荧光定量检测肿瘤相关基因c-myc、bcl-2、mdm2、p21、p27 mRNA表达量,结果发现p53缺失后,c-myc、bcl-2表达量明显增加,而p21、p27表达量减少;运用流式细胞术检测两细胞系的细胞周期分布,结果发现在感染ALV-J后72h起,DF-1细胞G2/M期细胞的数目显著增多,在120h达到最大,约为p53-KO-DF-1细胞的3倍,表明p53敲除阻止了ALV-J诱导的G2/M期细胞阻滞;运用流式细胞术检测两细胞系细胞凋亡率变化,结果发现在感染ALV-J后,p53-KO-DF-1细胞的凋亡率明显低于DF-1细胞的凋亡率,结果说明p53敲除阻止了ALV-J诱导的DF-1细胞凋亡。突变型p53丧失了抑癌基因的功能:p53-KO-DF-1细胞系转染野生型(wtp53)及突变型(mtp53)质粒并感染ALV-J后,通过荧光定量检测病毒复制及肿瘤相关基因表达,结果发现在感染ALV-J后,mtp53促进ALV-J在p53-KO-DF-1细胞中的复制,并促进mdm2表达。而过表达wtp53时,ALV-J感染p53-KO-DF-1后,wtp53修复损伤,抑制mdm2表达,在48h前促进p21过表达,结果说明p53与p21基因协同抑制ALV-J的早期复制;通过Western Blot分析野生型及突变型p53基因对细胞自噬的影响,结果发现在感染病毒36h之前,wtp53过表达引起明显的细胞自噬;通过流式细胞术分析发现在感染ALV-J之后,随时间增加,wtp53转染组引起DF-1细胞大量凋亡,在120h凋亡数量高达90%,而mtp53转染组在感染ALV-J后期引起细胞凋亡明显减少,结果说明p53发生突变后促进细胞增殖,抑制细胞凋亡。综上所述,本研究结果证示细胞感染ALV-J后,通过上调p53和p21表达,使细胞在G2/M期发生阻滞,并诱导细胞凋亡,以此来抑制病毒的复制。p53敲除细胞系中,ALV-J诱导的G2/M期细胞阻滞及凋亡能力降低,从而有利于病毒的复制。wtp53过表达可促进ALV-J感染细胞发生凋亡及自噬,从而抑制ALV-J的细胞内复制,这是细胞防制ALV-J感染的重要机制。mtp53过表达可促进病毒在细胞中的复制,并促进ALV-J诱导c-myc、bcl-2的过表达,同时抑制细胞凋亡和细胞自噬的发生,阻滞细胞周期的能力减弱,这可能是p53突变及过表达发挥致瘤作用的重要机制。