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研究背景非编码RNA(Non-coding RNA,nc RNA)是由非编码基因转录而来的RNA,根据其长度主要分为长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA)和微小RNA(micro RNA,mi RNA)。Lnc RNA是指超过200个核苷酸长度的非编码RNA,可以通过碱基互补配对与RNA、DNA发生特异性结合;Mi RNA长度一般为18～24个核苷酸,可以与相应蛋白质编码基因信使RNA(message RNA,m RNA)特异性结合,通过抑制翻译过程或者降解m RNA来调节基因表达。Lnc RNA、mi RNA、m RNA三者通常可以通过碱基互补原则相互作用,通过竞争性内源性RNA(Competing endogenous RNA,ce RNA)机制来调节蛋白编码基因的表达水平,并在各种疾病的发生发展中扮演重要角色,包括肿瘤,心血管疾病以及自身免疫病。强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis,AS)是一种主要危及中轴骶髂关节的系统性炎症性自身免疫病,主要病理特点为肌腱、韧带附着点的慢性进行性炎症和新骨形成。研究表明多种mi RNA可以通过调节Dickkopf相关蛋白1(Dickkopf related protein 1,DKK-1)的表达参与到AS发病机制中,然而很少有研究探究上游lnc RNA在AS发生发展过程中的作用。研究目的本研究旨在探讨lnc RNA IFNG-AS1在AS发病中的作用。首先进行病例对照研究探讨AS患者及健康对照中IFNG-AS1及DKK-1的转录水平。随后培养AS患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),进行小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA)转染,探究相应mi RNA及DKK-1转录水平的改变。研究方法本次研究的主要目的是探讨调控AS相关基因DKK-1表达的lnc RNA、mi RNA、m RNA相互作用网络。首先在AS患者及健康对照人群中进行相关lnc RNA的筛选及相关细胞因子的表达水平的确定,经过文献阅读,生物信息学分析,本次研究确定潜在候选lnc RNA为IFNG-AS1与OIP5-AS1,mi RNA为mi R-29a和mi R-181c。在AS患者及健康对照PBMCs中进行实时定量荧光PCR(Quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,q RT-PCR)对于差异表达的lnc RNA进行筛选,同时运用酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定DKK-1及相关细胞因子在血浆中表达水平,并且结合患者临床特征进行分析。然后在AS患者PBMCs中进行lnc RNA的表达敲低,对信号通路进行验证。收集AS患者PBMCs,进行细胞培养,同时进行si RNA转染,检测相应的lnc RNA,mi RNA,DKK-1和相应细胞因子的转录或表达水平的变化。结果第一阶段病例对照研究纳入49名AS患者及49名健康对照。AS患者PBMCs中IFNG-AS1相对转录水平显著提高(Z=-2.451,P=0.014),OIP5-AS1在AS患者及健康对照者中无显著性差异(Z=-0.978,P=0.328),DKK-1在AS患者及健康对照者中转录水平无显著性差异(Z=-1.536,P=0.125)。经ELISA方法检测AS患者及健康对照者血浆中DKK-1,白细胞介素(Interleukin,IL)-6,肿瘤坏死因子(Tumour necrosis factor,TNF)-α三种细胞因子的表达水平,发现AS患者外周血血浆中IL-6水平显著升高(Z=-2.491,P=0.013),而DKK-1与TNF-α在AS患者及健康对照血浆中无显著性差异。利用q RT-PCR进行转染效率检测,与阴性对照转染组相比,si RNA敲低效率达40%以上共13个样本,IFNG-AS1相对转录水平为0.479(0.326,0.575),si RNA转染组mi R-29a的相对转录水平显著升高为1.782(1.162,2.289;Z=-2.494,P=0.013),mi R-181c在si RNA转染组的相对转录水平无显著性变化1.873(0.860,2.978;Z=-0.356,P=0.722),DKK-1在si RNA转染组相对转录水平也无显著变化0.873(0.728,1.358;Z=-1.781,P=0.075)。收集培养液离心上清用ELISA检测其中细胞因子DKK-1,IL-6,TNF-α表达水平。在13组si RNA转染组的细胞培养上清液中DKK-1与TNF-α的表达水平无显著差异(t=1.846,P=0.077,t=1.783,P=0.087),IL-6表达水平下降(t=1.846,P=0.077,t=2.763,P=0.011)。结论(1)本次研究发现AS患者相较于健康对照PBMCs中IFNG-AS1转录水平升高,表明IFNG-AS1可能参与到AS发病机制中。(2)利用si RNA敲低AS患者PBMCs中IFNG-AS1转录水平后,PBMCs中mi R-29a相对转录水平上升,DKK-1相对转录水平降低,提示我们IFNG-AS1可以通过mi R-29a调节DKK-1表达参与AS发病机制。