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背景：乳腺叶状肿瘤(Breast phyllodes tumors)为罕见的具有上皮及间质双相恶变的乳腺纤维上皮性肿瘤[1]，是研究上皮间质相互作用和上皮间质转化的理想载体。乳腺叶状肿瘤具有局部复发和远处转移的特性，严重影响患者的预后和健康。 EZH2参与肿瘤的发生发展、侵袭迁移的过程[2，3]，Wnt/β-catenin信号通路影响细胞极性、细胞粘附、细胞凋亡和肿瘤发生过程[4，5]，二者在肿瘤干细胞的自我更新、上皮间质转化中均发挥重要作用。研究者通过免疫组化研究发现，乳腺叶状肿瘤组织中上皮Wnt/β-catenin信号通路的激活可以促使乳腺叶状肿瘤的间质过度生长[6，7]。同时发现恶性乳腺叶状肿瘤组织中EZH2过度表达，并且与基质上皮下ALDH1高表达共同支持乳腺叶状肿瘤可能来自肿瘤干细胞的假说[8]。研究证实EZH2参与Wnt/β-catenin通路的调控[9]和促进上皮间质转化过程，通过激活β-catenin的信号传导，EZH2能够增强乳腺癌干细胞的自我更新和增殖能力。但目前仍缺乏实验证实EZH2能否通过Wnt/β-catenin信号通路影响乳腺叶状肿瘤细胞，进而影响乳腺叶状肿瘤的生物学行为。 乳腺叶状肿瘤缺乏有效治疗方法，尚需实验证实有效靶点以解决复发和放化疗抵抗问题。EZH2可能是乳腺叶状肿瘤治疗的潜在重要靶点，可能通过促进乳腺叶状肿瘤细胞的干细胞作用，从而促进乳腺叶状肿瘤的发生、发展、复发及放化疗抵抗，有待进一步的实验证实。 目的：本实验以人恶性乳腺叶状肿瘤细胞系(MCP-1)为研究对象，探讨EZH2对人乳腺叶状肿瘤细胞增殖、迁移侵袭、凋亡、干性、EMT方面的影响;探讨EZH2在人乳腺叶状肿瘤细胞中对Wnt/β-catenin信号通路的影响及相关机制，为乳腺叶状肿瘤新的治疗方案提供理论基础。 方法：实验将MCP-1细胞分为无关序列转染组（NC组）、EZH2-shRNA转染组（EZH2-shRNA组）两组。 (1)采用细胞活力实验（CCK-8法）、克隆形成实验检测下调EZH2对MCP-1细胞增殖能力的影响，Western Blot检测增殖相关蛋白PCNA蛋白表达水平变化。 (2)划痕实验、Transwell迁移和Transwel matrigel侵袭实验检测下调EZH2对MCP-1细胞迁移侵袭能力的影响，Western Blot检测侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9蛋白表达水平变化。 (3)Tunel实验、Hoechst33258实验检测下调EZH2对MCP-1细胞凋亡能力的影响，Western Blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl2、cleaved PARP、cleaved Caspase3蛋白表达水平变化。 (4)细胞免疫荧光实验检测下调EZH2对MCP-1细胞EMT过程的影响，Western Blot检测EMT标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、Snail1蛋白表达水平变化。 (5)细胞成球实验检测下调EZH2对MCP-1细胞干性增殖能力的影响，Western Blot检测肿瘤干细胞标志物ALDH1、SOX2、OCT4蛋白表达水平变化。 (6)RT-PCR检测下调EZH2的MCP-1细胞中Wnt/β-catenin通路中的β-catenin、GSK-3β的RNA表达变化、Western Blot检测Wnt/β-catenin通路中β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表达变化。 结果：(1)下调EZH2对乳腺叶状肿瘤细胞MCP-1增殖能力的影响 与NC组比较，细胞活力实验（CCK-8法）实验结果显示EZH2-shRNA组吸光度值明显降低，克隆形成实验结果显示EZH2-shRNA组克隆细胞集落形状明显变小及克隆细胞数均明显减少，Western Blot实验结果显示EZH2-shRNA组PCNA的蛋白表达明显降低，说明下调EZH2显著降低MCP-1细胞增殖能力。 (2)下调EZH2对乳腺叶状肿瘤细胞MCP-1迁移、侵袭能力的影响 与NC组比较，划痕实验结果显示EZH2-shRNA组迁移率明显降低，transwell迁移实结果显示EZH2-shRNA组穿膜的细胞数量明显减少，transwell matrigel侵袭实验结果显示EZH2-shRNA组穿透matrigel胶的细胞数量明显减少，Western Blot实验结果显示EZH2-shRNA组MMP-2、MMP-9的蛋白表达明显降低，说明下调EZH2显著降低MCP-1细胞迁移侵袭能力。 (3)下调EZH2对乳腺叶状肿瘤细胞MCP-1凋亡能力的影响 与NC组比较，Tunel凋亡实验结果显示EZH2-shRNA组细胞Tunel标记的阳性荧光细胞比例明显增加，Hoechst33258凋亡实验结果显示EZH2-shRNA组细胞标记阳性荧光细胞比例明显增加，Western Blot实验结果显示Bcl2的蛋白表达明显降低、Bax、cleaved PARP、cleaved Caspase3的蛋白表达明显增高，说明下调EZH2显著增加MCP-1细胞凋亡能力。 (4)下调EZH2对乳腺叶状肿瘤细胞MCP-1的EMT过程的影响 与NC组比较，细胞免疫荧光实验结果显示EZH2-shRNA组细胞中E-cadherin组荧光强度明显增加、N-cadherin、Snail1组荧光强度明显降低，Western Blot实验结果显示EZH2-shRNA组E-cadherin的蛋白表达明显增高、N-cadherin、Snail1的蛋白表达明显降低，说明下调EZH2显著抑制MCP-1细胞EMT过程。 (5)下调EZH2对乳腺叶状肿瘤细胞MCP-1的干性作用的影响 与NC组比较，细胞成球试验结果显示:EZH2-shRNA组细胞成球能力显著降低，Western Blot实验结果显示EZH2-shRNA组ALDH1、Sox2、Oct4的蛋白表达明显降低，说明下调EZH2显著降低MCP-1细胞干性作用。 (6)下调EZH2对乳腺叶状肿瘤细胞MCP-1中Wnt/β-catenin通路的影响 与NC组比较，RT-PCR实验结果显示EZH2-shRNA组β-catenin的RNA表达明显降低、GSK-3β的RNA表达明显增加，Western Blot实验结果显示EZH2-shRNA组β-catenin、p-GSK-3β蛋白表达明显降低、GSK-3β的蛋白表达明显增加，说明下调EZH2明显抑制MCP-1细胞中Wnt/β-catenin通路。 结论：(1)乳腺叶状肿瘤细胞中下调EZH2可以抑制肿瘤细胞的增殖、迁移侵袭和肿瘤细胞EMT过程、干性作用，促进肿瘤细胞凋亡;(2)乳腺叶状肿瘤细胞中下调EZH2可以抑制Wnt/β-catenin通路。因此抑制EZH2的表达具有多途径治疗乳腺叶状肿瘤的潜在临床价值。