乳腺癌是中国女性最常见的恶性肿瘤,其发病率正在逐年增加。降低乳腺癌死亡率和改善患者预后的最佳措施是实现乳腺癌的早期发现、早期诊断和早期治疗。目前,乳腺癌的早期诊断主要依赖于钼靶、超声等影像检查手段,影像设备的不同及诊断医生个体水平的差异,制约了早期诊断总体水平的提高。探讨乳腺癌发病机制,寻找敏感性、特异性较强的生物标志物,用于诊断和判断预后,并由此寻找新的治疗靶点,成为近年来乳腺癌研究的热点之一。色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)因其多方面的抗肿瘤活性,而愈发引起人们的关注。PEDF是一种分子量为50kDa的分泌性糖蛋白,属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的一种非抑制性蛋白,在进化过程中,其基因序列高度保守,位于染色体17p13.3位点。目前已知PEDF在成人及婴儿组织中广泛表达,包括成人脑、脊髓、血浆、肝脏、骨、眼、心脏及肺组织等。PEDF的多重性生物作用正在被逐渐明确,如神经保护、神经营养、抗新生血管生成和促进细胞凋亡等。近年来,有研究表明,PEDF表达水平的降低与肿瘤的发生、发展密切相关。目前认为,PEDF主要通过以下三种路径发挥其抗肿瘤作用：(1)抑制肿瘤新生血管的形成(2)促进肿瘤细胞凋亡(3)诱导肿瘤细胞分化成熟。乳腺导管内增生性病变(intraductal proliferative lesions, IDPL)是一组细胞学和组织学多样性的增生性病变,典型者发生自终末导管小叶单位(terminalduct-lobular unit, TDLU),依据它们的结构和细胞学特性,这组病变可分为四种主要类型,普通导管上皮增生(usual ductal hyperplasia, UDH)、平坦型上皮不典型性(flat epithelial atypia,FEA)、导管上皮不典型增生(atypical ductla hyperplasia, ADH)、导管原位癌(ductal carcinoma in situ, DCIS)。这类病变与发生浸润性乳腺癌的危险性有不同程度的相关性。研究这类病变的目的是为了从本质上认识这些病变,揭示其与浸润性乳腺癌的关系,以及其在乳腺癌的发生、发展过程中所处的位置,以便采取适当的措施,达到遏制其发展成为浸润性癌的目的。目前PEDF与乳腺癌的相关性研究主要有以下几方面：首先,有研究定量检测了乳腺癌组织与正常乳腺组织中的PEDF表达情况,结果显示,PEDF在乳腺癌组织中的表达显著减少。由此推断出PEDF表达的下调或缺失在乳腺癌的发生及进展过程中扮演重要角色。但是目前尚无PEDF在乳腺良性增生性疾病中的研究,本研究的第一部分,着重选取乳腺导管增生性病变发展过程中的几个环节,探讨PEDF表达水平的变化与乳腺疾病进展的关系。其次,在多种恶性肿瘤中,PEDF的抗新生血管作用体现在降低肿瘤的微血管密度(micro vascular density, MVD)方面。PEDF抗肿瘤新生血管形成的作用,是否体现在宏观影像可见的水平,目前尚无相关研究资料。本研究的第二部分,通过对乳腺癌的超声影像进行定量分析,探讨PEDF的表达水平与乳腺癌超声影像特征间的相关性。再次,关于乳腺癌病灶PEDF表达水平与临床预后指标的相关性研究结果均表明,病灶内PEDF的低表达,与疾病的不良预后相关。对此,在本研究中我们将做进一步探讨,并以PEDF为桥梁,探讨通过术前超声影像表现评估乳腺癌患者预后的可行性。最后,在关于PEDF与卵巢癌的相关研究中发现,雌二醇(estradiol, E2)是PEDF重要的上游调节因子。E2水平的升高,可导致PEDF在mRNA及蛋白质水平的下调,其作用是通过雌激素受体(estrogen receptor, ER)介导的。这提示我们,对于同样与内分泌密切相关的乳腺癌,ER的表达情况与PEDF的水平可能存在相关性,但是目前我们的研究尚未证实这一点。这可以作为我们今后的研究方向之一,有助于我们进一步深入了解乳腺癌内分泌治疗的机制,并且更准确的筛选内分泌治疗的敏感人群。第一部分PEDF在乳腺导管内增生性病变与浸润性导管癌中的表达及临床意义研究研究目的1.探讨PEDF表达水平变化与乳腺疾病进展的关系,进而分析PEDF作为生物标记用于乳腺癌早期诊断的可能性。2.探讨乳腺癌组织中PEDF表达水平与预后指数的关系,评估PEDF预测肿瘤生物学行为及预后的价值。3.探讨PEDF与乳腺癌新生血管生成的关系,评估PEDF作为乳腺癌新的治疗靶点的可能性。材料与方法收集2010年1月至2011年6月期间在南方医科大学附属深圳妇幼保健院经病理诊断明确的乳腺组织石蜡标本,共124例,其中,乳腺普通导管上皮增生26例,导管上皮不典型增生31例,导管原位癌15例,浸润性导管癌52例。获取所有纳入病例的临床病理资料,包括患者的年龄、月经状态、肿块的大小、病理分级、分期、激素受体表达情况等。用免疫组化方法检测所有组织标本中PEDF蛋白的表达情况。统计分析用x2检验或Mann-Whitney秩和检验方法,以P<0.05作为差异有统计学意义的标准。结果1.乳腺导管内增生性病变共72例,PEDF蛋白表达阳性者41例,阳性率56.9%；乳腺浸润性导管癌共52例,PEDF蛋白表达阳性者14例,阳性率26.9%。两者差异具有统计学意义(P=0.001),即乳腺浸润性导管癌病灶中的PEDF蛋白表达水平显著低于乳腺导管上皮增生性病变。2. PEDF蛋白在普通导管上皮增生、导管上皮不典型增生及导管原位癌患者中表达的阳性率分别为65.4%、51.6%、53.3%,三者比较差异无统计学意义(P=0.550),即PEDF蛋白在乳腺导管上皮增生性病变各阶段间的表达无明显差异。3.52例浸润性导管癌患者,依据肿瘤大小分为≤2.0cm组及>2.0cm组,两组的PEDF蛋白表达阳性率分别为57.1%和6.5%,差异有统计学意义(P<0.001),即肿瘤直径>2.0cm的病灶中,PEDF蛋白表达阳性率显著降低。淋巴结转移阴性与阳性组的PEDF蛋白表达阳性率分别为40%和9.1%,二者差异显著(P=0.030),即淋巴结转移阳性组的PEDF蛋白表达阳性率显著降低。同样,在与肿瘤大小及淋巴结转移情况密切相关的TNM分期中,早期乳腺癌患者(Ⅰ期,18例)组与中晚期乳腺癌患者(Ⅱ—Ⅳ期,34例)组相比,PEDF蛋白表达水平的差异同样具有显著性(P<0.001),即在中晚期患者组,其表达阳性率显著降低。依据患者的年龄、月经状态以及组织学分级、ER、PR的表达情况等进行分组,差异均无统计学意义(P值分别为0.724,1.000,1.000,0.789,0.211)。4.用诺丁汉预后指数(Nottingham prognostic index, NPI)来评估患者的预后,NPI<3.4、3.4-5.4和>5.4的患者分别为1、2、3级,其中1级患者预后较好,共14人,PEDF蛋白表达阳性率64.3%,3级的患者预后较差,共16人,阳性率6.3%,2级患者的预后情况介于二者之间,共22人,阳性率18.2%。三组之间差异有显著性(P=0.001),即在NPI评分较高(预后较差)的组中,PEDF蛋白表达阳性率显著降低。5.52例乳腺浸润性导管癌患者中,VEGF表达阳性者30例,阴性者22例,VEGF阳性患者的PEDF表达阳性率为13.3%,VEGF阴性患者PEDF表达阳性率为45.5%,二者差异有统计学意义(P=0.026),即在VEGF阳性患者组,PEDF表达阳性率明显降低。分析二者的关联性,Spearman列联系数C=—0.308,二者之间具有负向关联性。结论1.乳腺浸润性导管癌病灶中的PEDF蛋白表达水平较乳腺导管内增生性病变中显著降低,提示PEDF在乳腺癌的而发生发展中发挥作用。2. PEDF蛋白在乳腺癌组织中表达下调或缺失与乳腺癌病灶大小、淋巴结转移、临床分期有关,提示PEDF蛋白的表达水平对患者预后判断有参考价值。3.乳腺浸润性导管癌中PEDF蛋白与VEGF蛋白表达水平的负向关联性,提示PEDF可能作为乳腺癌抗血管生成治疗的新靶点。第二部分PEDF的表达与乳腺癌超声征象的相关性研究研究目的1.探讨PEDF表达水平与乳腺癌超声血流信号的关系,进而分析PEDF对乳腺癌新生血管生成的影响是否具有宏观的影像表现。2.探讨PEDF表达水平与乳腺超声恶性征象间的相关性,进而评估以PEDF为桥梁,通过术前超声表现判断乳腺癌患者预后及肿瘤的生物学行为的可行性。材料与方法选择2010年1月至2011年6月期间在南方医科大学附属深圳妇幼保健院经病理诊断明确为乳腺癌的患者,共62例,其中浸润性导管癌52例,浸润性小叶癌6例,粘液癌3例,浸润性筛状癌1例。所有患者术前行高频超声及彩色多普勒超声检查,并记录肿块的大小、形态、边界、后方回声、内部钙化、纵横比等超声征象,用彩色多普勒技术探测肿块血流情况,按照Alder半定量分级标准进行血流分级。综合上述信息,根据美国放射学会制订的乳腺影像报告与数据系统(Breast imaging and reporting data system, BI-RADS)(第四版)标准对乳腺病灶进行描述和分级。超声检查图像及病理切片资料齐全。用免疫组化方法测得所有石蜡组织标本中PEDF蛋白的表达情况。统计分析用x2检验、Fisher确切概率法或Mann-Whitney秩和检验方法,以P<0.05作为差异有统计学意义的标准。结果1.62例乳腺癌病灶依据血流情况分为四级,其中0级19例,Ⅰ级13例,Ⅱ级16例,Ⅲ级13例。PEDF蛋白表达的阳性率分别为47.4%(9/19)、30.8%(4/13)、31.3%(5/16)、7.1%(1/14)。经统计分析,差异具有显著性(P=0.021)。即肿块血流丰富的血流分级为Ⅲ级的乳腺癌组织中,PEDF蛋白表达阳性率较低。与之相反,在未见血流信号的0级的乳腺癌组织中,PEDF蛋白表达阳性率较高。2.不同类型的乳腺癌组织石蜡标本共62例,其中浸润性导管癌52例,PEDF蛋白表达阳性率为26.9%(14/52),浸润性小叶癌6例,阳性率50%(3/6),而预后相对较好的浸润性癌(粘液癌+浸润性筛状癌)4例,阳性率50%(2/4)。三者比较,差异无统计学意义(P=0.330)。3.62例浸润性乳腺癌患者的PEDF表达情况与超声影像特征间的相关性分析显示,仅依据肿瘤大小一项指标的分组中,差异具有显著性(P=0.002)。在肿瘤大小≤2.0cm组及>2.0cm组中,两组的阳性率分别为44.4%和7.7%。即在肿瘤直径>2.0cm的病灶中,PEDF蛋白表达阳性率显著降低。另外,依据肿块的形态、边界、后方回声、纵横比、内部钙化等因素进行分组,差异均无统计学意义。结论1. PEDF对乳腺癌新生血管生成的抑制作用,不仅表现在抑制微血管生成方面,而且有超声可见的宏观影像表现。2.乳腺癌超声表现在一定程度上反映了肿瘤组织中PEDF蛋白的表达水平,对评估乳腺癌的生物学行为和患者的预后具有一定价值。