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神经节苷脂GM3作为一种促分化剂已在多个细胞瘤株模型中得到证实,但迄今为止其促分化的详细机制仍未阐明。本课题前期研究工作发现,神经节苷脂GM3诱导人单核样白血病J6-2细胞沿单核/巨噬细胞途径分化的同时,可抑制J6-2细胞磷脂酰肌醇(PI)特异的磷脂酶C(PI-PLC),使细胞二脂酰甘油(DAG)水平降低,从而抑制蛋白激酶C(PKC)由胞液向质膜的转位及活化。PI-PLC的作用是水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)生成两个细胞内重要的第二信使DAG和1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)。迄今已发现PLC有十余个同工酶。根据结构不同分为PLC((包括PLC(1-3),PLC((包括PLC(1和PLC(2)和PLC((包括PLC(1-3)。不同亚型的PLC在组织细胞中分布不同,其活化机制也不同。已知PLC(家族成员由G蛋白偶联受体激活,PLC(1和PLC(2由生长因子受体激活。因此,要弄清GM3抑制J6-2细胞PLC的机制,首先要确认GM3所影响的PLC的类型。本文着重观察GM3对J6-2细胞PLC(的影响,从而对GM3抑制PLC活性机制进行探讨。目前尚无测定细胞内单一类型PLC活性的特异性方法,但已知PLC(活化的两个必要条件是磷酸化和由胞浆向质膜转位。本文采用洋地黄皂甙(Digitonin)增加细胞膜渗透性,释放胞液蛋白,通过离心将细胞蛋白分为胞液蛋白和颗粒结合蛋白两部分,然后采用SDS-PAGE,Western blot及酶联免疫显色技术,并结合计算机扫描半定量技术,<WP=5>检测了GM3处理前后PLC(1在细胞内的转位情况。结果发现:GM3处理组J6-2细胞胞液部分PLC(1与对照组相比显著增加,而颗粒结合部分PLC(1则相对减少。这一结果说明,GM3抑制了PLC(1由胞浆向质膜的转位,提示GM3抑制PLC亚型可能是PLC(1。PLC在质膜上的定位是发挥其催化作用的必要条件,已知PLC(1含有PH结构,可借助于PH结构与质膜上的PIP3识别结合,并借以定位于质膜。因此,质膜PIP3的含量是影响PLC(在质膜定位的重要分子。本文采用无载体32P标记细胞质膜磷脂后,用有机溶剂提取,高效薄层层析,放射自显影结合计算机扫描半定量技术,观察了GM3对J6-2细胞PIP3含量的影响。发现GM3处理组细胞PIP3含量明显减少,仅为对照组的10%左右,这一结果说明GM3显著抑制PI3K活性,从而使PIP3产生减少。这可能是GM3抑制PLC(1向质膜转位的重要原因之一。PLC(主要由活化的生长因子受体激活。生长因子与受体(受体型酪氨酸蛋白激酶)结合使受体二聚体化并自身磷酸化被活化,活化的受体胞内区域形成磷酸化酪氨酸位点。PLC(可借自身的SH2结构与受体磷酸化位点结合,然后在受体激酶催化下磷酸化被激活。本文进一步观察了GM3对J6-2细胞一些生长因子受体(包括EGFR,INR,PDGFR等)磷酸化的影响。结果表明,GM3显著抑制EGFR的磷酸化,对其它生长因子受体磷酸化无显著影响。综上结果,作者推测GM3抑制J6-2细胞PLC活性至少可能通过两条途径。其一方面可以通过抑制PIP3的生成来抑制PLC(1的转位,另一方面也可通过抑制EGFR胞内部分酪氨酸磷酸化水平抑制PLC(1的活化。其结果使DAG水平降低,PKCα活性受到抑制。