[研究背景]肺癌是全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤,也是我国最常见的恶性肿瘤。近年来,包括我国在内的多数国家肺癌呈现高发与早发的趋势。在我国,因肺癌死亡者,男性居恶性肿瘤死亡的首位,女性也高居第二位。肺癌发生的病因及其确切的分子机制尚不十分清楚。现有的研究表明,导致肺癌发生的原因众多,吸烟可诱发肺癌；此外,有研究发现在遗传因素中,某个或多个基因的改变也会导致肺癌的发生。近期有研究表明,超过60种DNA分子在发生突变后会增加罹患肺癌的机率。由于肺癌的死亡人数一直居高不下,因此我们更需要对其发生、发展的原因和相关机制进行深入的研究。我们利用现有的分子生物学相关技术了解了肺癌在发生与发展过程中的一些机制,但想要全面地了解肺癌发生、发展的相关机制,我们还需要寻找更多的分子标记物。在这些有待发现的分子生物标记中,microRNA的发现引起了广泛关注,它可以通过表观遗传学机制来调控基因的表达。微小RNA (microRNA, miRNA)是一类非编码的单链小分子RNA,长度约为18-23个核苷酸,广泛存在于真核生物中。miRNA通过与靶基因的mRNA3’UTR不完全性地互补配对,从而抑制靶mRNA的翻译或者促使其降解,即在转录后水平与翻译水平调节靶蛋白的表达。目前对miRNA的研究发现,大约70%miRNA可调控人类基因表达。现有的研究证实miRNA在肺癌的发生、发展中起着重要的作用,而根据其作用的靶基因的不同,又将其分为具有癌基因或者抑癌基因生物学活性的miRNA。miR-100定位于人类染色体11q24.1,大小约为22个核苷酸。现有的研究表明,miR-100在不同的病变中呈现不同的表达方式。已有研究报道在膀胱癌细胞中,miRNA-100通过下调其靶基因mTOR,从而抑制膀胱癌细胞的生长、增殖。Deng等人研究证实,miRNA-100能够抑制乳腺癌干细胞(BrCSCs)的自我更新和分化能力,从而影响乳腺癌的进展。我们在前期的研究中发现miR-100在正常的人支气管上皮细胞BEAS-2B中高表达,而在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株中低表达。miR-100的生物学功能在NSCLC中未见深入研究。肿瘤细胞的快速增殖是实体肿瘤进展的先决条件,其中涉及到多种调控基因的功能缺失和表达异常。那么miR-100表达的下调对NSCLC的恶性进展是否起到促进作用?以及miR-100是如何促进NSCLC恶性进展的?本课题在结合miR-100在NSCLC的细胞株以及临床病例标本中的表达情况,通过改变NSCLC细胞中miR-100表达水平,然后在体外实验中检测NSCLC细胞株在增殖、周期以及转移方面的变化,并进一步探讨导致这些变化的相关机制,从而为NSCLC的临床诊断和治疗提供新的线索。[研究方法]1.用qRT-PCR检测人支气管上皮细胞(BEAS-2B)和NSCLC (A549、L18)细胞株,以及20例未经治疗的NSCLC患者组织标本和16名健康对照者的血清标本中miR-100的表达情况。2.以慢病毒为载体分别建立稳定表达miR-100-3p inhibitor & negative control和miR-100-3p mimics & negative control的A549、L18细胞株。3.用上述已经构建的稳定细胞株来研究miR-100-3p在NSCLC细胞中生物学功能。(1)MTT法和平板克隆实验检测A549和L18细胞株的细胞增殖能力,并绘制生长曲线。(2)流式细胞术检测A549和L18细胞株的细胞周期的变化情况。(3)细胞粘附实验检测A549和L18细胞株细胞黏附能力。(4)软琼脂半固体集落形成实验检测A549和L18细胞株的非锚定生长能力。(5) Transwell/Matrigel法检测A549和L18细胞株迁移和侵袭的能力。4.用Western blotting检测EMT相关marker,以及Frizzld-8、GSK-3β、β-catenin蛋白的表达情况。[研究结果]1.与人支气管上皮细胞BEAS-2B细胞比较,miR-100在肺癌细胞株,尤其是NSCLC细胞株A549和L18细胞株中低表达(p<0.01)；在20例NSCLC患者和相应的16例健康对照者的血清及其组织标本中检测发现,NSCLC患者中miR-100低表达(p<0.001)。2.成功构建了敲低miR-100-3p表达的A549细胞株,以及过表达miR-100-3p的L18细胞株。3. miR-100-3p对肺癌细胞生长的影响：MTT和平板克隆形成实验结果显示,在A549细胞株中敲低miR-100-3p的表达后,细胞增殖率以及细胞克隆形成率明显增加；而在L18细胞株中过表达miR-100-3p后,细胞增殖率与细胞克隆形成率明显降低。以上结果表明miR-100-3p的缺失促进了肺癌细胞的增殖和克隆形成能力。4. miR-100-3p对肺癌细胞周期的影响：流式细胞术检测细胞周期结果显示,在A549细胞株中敲低miR-100-3p的表达后,处于S期的细胞比例显著增高；而在L18细胞株中过表达miR-100-3p后,处于S期的细胞比例明显降低。这说明miR-100-3p的缺失使得肺癌细胞中S期细胞比例增加。5. miR-100-3p对肺癌细胞非锚定生长能力的影响：软琼脂集落形成试验结果显示,在A549细胞株中敲低miR-100-3p的表达后,与对照组相比,实验组集落形成个数明显增多并且体积较大；而在L18细胞株中过表达miR-100-3p后,实验组集落形成个数明显减少并且体积较小。以上结果表明miR-100-3p的缺失促进了肺癌细胞的非锚定生长能力。6. miR-100-3p对肺癌细胞黏附能力的影响：粘附实验结果显示,在A549细胞株中敲低miR-100-3p的表达后,细胞的粘附能力增强；而在L18细胞株中过表达miR-100-3p后,细胞的粘附能力降低。以上结果表明miR-100-3p的缺失增强了肺癌细胞的粘附能力。7. miR-100-3p对肺癌细胞迁移和侵袭能力的影响：Transwell小室检测结果显示,在A549细胞株中敲低miR-100-3p的表达后,细胞的迁移与侵袭能力显著增强；而在L18细胞株中过表达miR-100-3p后,细胞的迁移和侵袭能力明显减弱。以上结果表明miR-100-3p的缺失增强了肺癌细胞的迁移和侵袭能力。8. miR-100-3p的缺失参与了EMT的发生：细胞形态学实验结果表明,在A549细胞株中敲低miR-100-3p的表达后,细胞间连接变得松散。Western Blotting实验显示,上皮样marker钙黏蛋白(E-cadherin)表达减少,而间质样marker波形蛋白(Vimentin)表达增加。9.相关机制初步探讨：(1) Western blotting检测结果发现,在A549细胞株中敲低miR-100-3p的表达后,EMT间质样marker呈表达上调趋势,而上皮样marker呈表达下调趋势；而在L18细胞株中过表达miR-100-3p后,间质样marker呈表达下调趋势,而上皮样marker呈表达上调趋势。以上结果表明miR-100-3p的缺失使得A549细胞发生了EMT样变化。(2) Western blotting检测结果发现,在改变肺癌细胞株中miR-100-3p的表达后,Frizzld-8、GSK-3p、p-catenin蛋白的表达水平呈现明显的改变。这表明miR-100-3p参与了Wnt/β-catenin通路的调节。[结论]1.成功构建了低表达miR-100-3p的A549细胞株,以及过表达miR-100-3p的L18细胞株。2. miR-100-3p的低表达促进了NSCLC细胞的增殖、黏附、迁移、侵袭和非锚定生长能力,其在NSCLC进展中起到抑癌基因的作用。3. miR-100-3p促进NSCLC细胞恶性生物学进程,在此过程中EMT起着至关重要的作用；与此同时,miR-100-3p可能通过靶向作用于FZD8激活Wnt/β-catenin信号通路,从而促进NSCLC细胞恶性进展。