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一、研究背景与目的谷胱甘肽(GSH)是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸缩合而成的一种含有巯基的生物活性三肽化合物,以还原态(GSH)和氧化态(GSSG)两种形态存在。GSH在生物体内具有多种重要的生理功能,特别是对维持生物体内适宜的氧化还原环境起着至关重要的作用,在食品、医药、保健品、化妆品工业中均有广泛的应用价值。谷胱甘肽由于其特殊的功能正在被应用于许多领域,而我国的谷胱甘肽完全依赖进口,实现谷胱甘肽的国产化迫在眉睫。由于发酵法所使用的细菌或酵母容易培养,加之生产方法及工艺的不断改进和完善,因此采用微生物发酵法已成为目前谷胱甘肽工业化生产的最普遍方法。近30年来直接发酵法生产谷胱甘肽的研究成果中所采用的微生物,酵母一直是研究的首选。本文对发酵法生产谷胱甘肽高产酵母菌株的选育及培养条件进行了研究。采用紫外和60Co联用诱变和新型标记菌株原生质体融合选育技术选育较高谷胱甘肽产量菌株,为工业化生产提供理论依据和数据支持。二、研究方法1·谷胱甘肽抽提条件的优化:谷胱甘肽常采用发酵法生产,其存在于细胞内,要得到谷胱甘肽常采用一定的破壁手段,包括化学、物理、生物酶等方法。本文采用乙醇直接抽提的方法,对包括乙醇浓度、抽提温度以及抽提时间三个因素进行考察,找出最经济的抽提条件,并且通过正交分析方法对抽提的条件进行了优化。2·菌株培养基条件的优化:实验购买了一株产谷胱甘肽的产朊假丝酵母菌CⅠ,在摇瓶中对这一菌株的培养基进行了优化。研究了不同碳源、氮源、磷酸盐对发酵生产谷胱甘肽的影响。3·菌种选育:对菌株CⅠ分别进行紫外诱变、60Co诱变和二者的复合诱变,并对突变株进行氯化锌和乙硫氨酸交替的抗性物筛选。同时选出两株具有遗传标记的较高产量菌株采用原生质体融合技术选育菌种。4·培养条件优化:比较育种两种方法所获得的菌株,选取较优菌株UC1,通过对UC1摇瓶培养条件的考察得到较优培养条件。三、研究结果1、得到乙醇抽提优化条件:温度为50℃,反应时间90min,乙醇浓度为40%。提取条件优化后谷胱甘肽产量为75.1mg/L,比优化前提高了37.3%。2、确定合适的碳源为工业用葡萄糖,有机氮源为酵母粉,无机氮源为(NH4)2SO4,磷酸盐为KH2PO4和K2HPO4。正交试验确定的最佳培养基组成(g/L):葡萄糖25,酵母粉10,(NH4)2SO4 3,K2HPO4 1.2,KH2PO4 1.8;考察了不同的无机盐的影响,确定在培养基里添加0.3 g/L的MgSO4。培养基条件优化后酵母菌株的谷胱甘肽产量为96 mg/L,比优化前提高了27.8%。3、最终得到一株高产谷胱甘肽菌株UC1,谷胱甘肽产量为169.4mg/L,比优化后菌株CⅠ提高了76.5%。并获得胞内谷胱甘肽含量较高的标记性酵母菌株Z5 (高浓度氯化锌培养平板中产生透明圈,ZnCl2r)和C4 (淡黄色,Ethr)。其中Z5谷胱甘肽产量为121mg/L,比出发菌株CⅠ优化后提高了26%。C4谷胱甘肽产量为127mg/L,比出发菌株CⅠ优化后提高了32.3%。对标记性的两亲株Z5和C4进行单亲灭活融合。摸索了原生质体制备和再生的条件及融合条件,经过筛选、鉴定得到融合子R54,其生物量为10.4g/L,谷胱甘肽产量为157.2mg/L。谷胱甘肽产量比两亲株分别提高了29.8%和23.6%。4、较优培养条件为:培养温度30℃,培养基初始pH为6.5,接种量为10 %,250mL摇瓶装液量为30mL,培养时间33h。培养条件优化后GSH产量为172.7mg/L。总之,出发菌种CⅠ的谷胱甘肽产量由54.7mg/L提高到172.7mg/L,共提高了215.7%。