目的:本课题研究的目的是,验证丹酚酸B防治口腔黏膜潜在恶性病变(Oral Potentially Malignant Disorders,以下简称OPMDs)的有效性,以及比较丹酚酸B磷脂复合纳米颗粒(Sal B-PLC-NPs,以下简称Nano)防治口腔黏膜潜在恶性病变的活性是否比单纯的丹酚酸B(以下简称Free)更强。方法:本课题从体外细胞实验和动物模型体内实验两个方面(四个部分)展开。(一)体外细胞实验方面(包括第一部分实验):本部分实验采用Nano和Free作用于口腔鳞状上皮细胞癌细胞系HN13和HN30细胞(以下分别简称癌细胞A、癌细胞B)、口腔白斑细胞系Leuk1(以下简称白斑细胞),作相关比较研究:用激光共聚焦显微镜定性研究200μg/ml的Nano和Free分别作用于癌细胞A、癌细胞B和白斑细胞的2h细胞摄取药物的定性差异。用荧光分光光度计定量研究分析Nano和Free在2h时间节点上25、50、100、200μg/ml的浓度梯度以及200μg/ml浓度条件下5、10、20、30min、1h、2h时间梯度的癌细胞A、癌细胞B和白斑细胞摄取药物的定量差异。用MTS方法研究阴性空白对照组、Nano组和Free组对于癌细胞A、癌细胞B和白斑细胞在25、50、100、200μg/ml浓度梯度条件下,其24、48、72、96h时间梯度抑制细胞生长增殖作用的差异。用流式细胞仪分析比较Nano和Free作用于癌细胞A(200μg/ml-24h)、癌细胞B(100μg/ml-48h)、白斑细胞(200μg/ml-48h)的条件下,阻滞细胞增殖周期的差异。用流式细胞仪分析比较Nano和Free作用于癌细胞A(200μg/ml)、癌细胞B(100μg/ml)、白斑细胞(200μg/ml)的条件下,在24h和48h两个时间点诱导细胞凋亡的差异。(二)体内动物模型实验方面(包括第二、第三、第四部分实验):采用4NQO致癌剂诱导C57BL/6小鼠舌黏膜上皮癌变动物模型,灌胃给药干预实验动物18周,停药后继续观察4周,总共22周。进行大体观察和解剖记录、组织病理诊断、免疫组化检测细胞增殖和细胞周期指标表达的变化情况,比较Nano和Free防治4NQO诱导C57BL/6小鼠舌黏膜上皮癌变的活性。结果:(一)体外细胞实验结果:1、激光共聚焦显微镜下观测到,在Nano处理后的细胞内直观地显示出更多更强的亮蓝色荧光团。提示纳米剂型更容易被细胞摄取。2、Nano对癌细胞A在25、50、100、200μg/ml浓度、对癌细胞B在200μg/ml浓度、对白斑细胞在25、200μg/ml浓度作用2h后细胞内荧光强度比Free更强,具有统计学差异。提示对于不同系的癌细胞和OPMDs(口腔黏膜潜在恶性病变)细胞,其摄取纳米化药物峰值的药物浓度和时间节点是不同的。3、与阴性对照组相比,Nano和Free均具有抑制癌细胞A、癌细胞B和白斑细胞生长增殖的作用。其中:Nano对癌细胞A在200μg/ml-48h时、对癌细胞B在100μg/ml-96h时抑制细胞增殖作用明显强于Free;对白斑细胞在200μg/ml-96h时抑制细胞增殖作用有强于Free的趋势。提示:丹酚酸B无论对口腔鳞状上皮癌细胞或口腔白斑细胞都有抑制其生长增殖的作用,而纳米剂型对不同细胞系在特定时间和浓度条件下,其抑制活性优于非纳米剂型。4、Nano分别作用于癌细胞A(200μg/ml-24h)、癌细胞B(100μg/ml-48h)后,其增殖周期阻滞活性都比Free强。而Free作用于白斑细胞(200μg/ml-48h)后,阻滞作用比Nano更明显。细胞周期阻滞实验结果与细胞生长抑制曲线相符。5、Free诱导癌细胞A在200μg/ml-24h后凋亡率比Nano高;诱导癌细胞B在100μg/ml-48h后的早期凋亡率比Nano高;Free诱导白斑细胞在200μg/ml-24h和200μg/ml-48h后凋亡率比Nano更高。本实验结果与细胞生长抑制曲线相符。提示:从细胞周期及细胞凋亡以不同角度观察,均表现出丹酚酸B纳米剂型在特定的浓度和作用时间条件下,优于非纳米剂型。(二)体内动物模型实验结果:1、从8到30周小鼠生长发育良好,饮水先减、后增、再减,体重先增后减,没有出现意外死亡和其他疾病。小鼠自由饮用4NQO水溶液各组间没有统计学差异,说明4NQO对各组小鼠诱导致癌作用等同。根据小鼠体重变化曲线,早期小鼠体重平行增长,组间没有统计学差异,说明各组药物处理方式对小鼠没有明显毒性。2、根据4NQO阳性对照组小鼠的4、8、14、18、22周末大体解剖检查和病理诊断结果,小鼠舌黏膜上皮经历了“正常黏膜上皮→良性增生→轻度异常增生→中度异常增生→重度异常增生→黏膜上皮癌变及颈部淋巴结转移”的逐渐加重的程序式变化,说明本次实验所建立的4NQO诱导C57BL/6小鼠舌黏膜癌变动物模型是成功的。3、对药物干预组小鼠在8、14、18和22周末大体解剖检查和组织病理结果,进行评分和统计分析,发现Nano组小鼠的病情相对最轻,其次是Free组,4NQO阳性对照组病情最重,表明Nano比Free防治4NQO诱导C57BL/6小鼠舌黏膜癌变的活性更强。而相应的三个阴性对照组小鼠完全正常,说明无论是Nano或是Free都没有致癌、致畸的毒副作用。4、细胞增殖指标Ki-67、PCNA检测发现Nano具有更明显的抑制小鼠组织细胞生长增殖的趋势;5、细胞周期指标cyclin D1、p16检测表明Nano有更明显的阻滞小鼠组织细胞增殖周期的趋势。结论:本课题从体外细胞实验和体内动物模型实验两个方面证实了:1、丹酚酸B(无论纳米化或非纳米化剂型)均对HN13、HN30等口腔鳞癌细胞系、口腔白斑细胞,以及4NQO诱导的C57BL/6小鼠口腔黏膜癌变模型有抑制或阻滞作用,并且无明显毒性作用。2、细胞实验和动物实验均表明,在某些特定的药物浓度和时间节点条件下,纳米化的丹酚酸B抑癌活性比非纳米化的的丹酚酸B更强。3、纳米化的丹酚酸B比非纳米化的丹酚酸B被细胞摄取量更大,并在某些特定剂量和时间节点上,在细胞增殖、凋亡等流式细胞仪检测指标方面反应出更好的作用。这些现象是否可以用于解释纳米化丹酚酸B比非纳米化剂型抑癌活性更强,值得进一步研究。