近年来,由于采矿、发电以及金属冶炼等现代工业的快速发展,重金属污染尤其是镉的污染事件时有发生,使生物种群和生态系统受到严重破坏。研究发现,镉可以影响生物有机体内的物质和能量代谢等过程,严重时甚至改变物种的迁徙和卵子发生等与繁殖相关的生命活动。卵子发生是甲壳动物卵巢发育中的一个重要阶段,卵母细胞成熟过程中卵黄磷蛋白原(Vitellogenin, Vg)的形成和积累是其主要特征。Vg通过进一步的修饰和加工形成包含有脂肪和糖类等物质的卵黄磷蛋白(Vitellin, Vn)可在卵母细胞中积累形成卵黄体。当生物有机体受到外部环境胁迫时,通过消耗体内积累的脂肪等物质产生充足的能量以合成金属硫蛋白(Metallothionein, MT)以缓解外部的影响。还原型辅酶Ⅱ(NADPH)作为生物体内一种重要的还原力,不仅参与维持体内谷胱甘肽系统的平衡、缓解外部的胁迫,还是脂肪合成中的重要因素。本学位论文在课题组前期研究的基础上,从细胞生物学、分子生物学和生物化学等多层次综合研究并分析了镉亚慢性染毒后,对河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)肝胰腺和卵巢组织中脂肪代谢的影响,阐明了镉对生殖的影响机制。表明镉对水生动物早期影响的生化和繁殖参数,可以作为在水生生态毒理学研究中污染物对生物种群影响的重要指标和科学依据。实验中具体利用了比色法、透射电镜技术(Transmission electron microscopy, TEM)、免疫学和凝胶过滤层析等方法。主要的生化指标包括脂肪含量、甘油三酯(Triglyceride, TG)含量、ATP/ADP、 NADH/NAD、线粒体膜电位(Δψm)、NADPH/NADP+等参数；脂肪消化代谢相关的胰脂肪酶(Pancreatic lipase,PL)、脂肪转运相关的脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase,LPL)及参与脂肪合成代谢的乙酰CoA羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FAS)；线粒体能量合成代谢相关的己糖激酶(Glucokinase, GK)、NAD+-异柠檬酸脱氢酶(NAD+-linked isocitrate dehydrogenase,NAD+-IDH)、细胞色素C氧化酶(Cytochrome C oxidase,COX)等酶的活性及IDH和COX mRNA表达；NADPH合成依赖酶：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PDH)、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGDH)、苹果酸酶(Malic enzyme, ME)、NADP+依赖型异柠檬酸脱氢酶(NADP+-linked isocitrate dehydrogenase,NADP+ -IDH)等酶的活性；参与缓解氧化胁迫的谷胱甘肽系统：还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量、GSH/GSSG、谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase,GR)活性、MT和脂质过氧化指标丙二醛(Malondialdehyde,MDA)。采用TEM手段观察了镉处理后肝胰腺细胞线粒体和内质网等显微结构的改变。应用转录组学的方法,确定了Vg的核酸序列全长,通过生物信息学的方法对Vg进行了分析；基于逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)方法,研究了该基因在不同组织内的表达,并通过Vg序列构建了系统进化树；通过凝胶过滤层析法纯化了成熟卵巢中的Vn,采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳确定了Vn亚基数量及分子量；以纯化的Vn为抗原,制备了Vn多克隆抗血清,并建立了可靠的Vn含量测定的ELISA方法；最后,运用酶联免疫和实时荧光定量PCR等多种方法检测了镉暴露对肝胰腺和卵巢等组织中Vn含量、Vg mRNA表达及糖代谢和蛋白代谢的影响。结果显示：首先,镉在河南华溪蟹组织中的蓄积具有浓度和时间效应关系。随着镉处理浓度的升高和处理时间的延长,肝胰腺和卵巢中镉的蓄积量呈现升高趋势,而脂肪的含量则呈现降低趋势,导致肝胰腺和卵巢指数的降低进而影响了组织器官的发育。镉处理10d,淋巴液中TG含量显著高于对照,但随着时间的延长呈现持续下降的趋势。参与脂肪消化的PL和脂肪合成的ACC和FAS酶活高于对照组；镉处理20d,PL、LPLACC和FAS活性均低于10d的镉处理组和对照组,并随着镉浓度的升高呈现下降的趋势。其次,与对照组相比,镉处理10d后的各染毒组组织细胞内NAD+-IDH口COX活性的增强及mRNA表达水平的上调,引起了NADH含量及NADH/NAD的显著增高,并由此导致了高水平的△ψm及ATP含量上升。然而,随着镉处理时间的延长,参与能量代谢的GK、IDH和COX酶活性及相关酶mRNA表达水平下降,且在镉处理20d该指标显著低于对照组。TEM观察发现,线粒体结构出现肿胀、膜破裂、内膜嵴变短、线粒体破裂和内质网损伤等现象,使组织细胞中的NADH含量和Δψm水平下降,最终导致ATP含量减少。还有,镉处理早期,G6PDH、6PGDH、ME和NADP-IDH等酶活性升高加速了磷酸戊糖代谢等NADPH合成途径,引起组织中NADPH含量上升；GR活力显著升高导致谷胱甘肽氧化还原循环再生途径得到加强,GSH合成速率升高。MT含量的显著升高也表明在该阶段蟹体具有较强的抗镉胁迫能力。然而,随着镉处理时间的延长,体内NADPH及GSH的合成代谢逐渐减弱。镉处理20d, NADPH合成依赖的酶活力受到抑制,引起NADPH含量降低,谷胱甘肽氧化还原循环再生途径也因此受阻；GR活性由于受到镉的胁迫而出现降低。因此,镉对NADPH合成及谷胱甘肽原循环中关键酶GR活性的抑制,导致GSH合成速率下降,并最终引发GSH含量的降低和耗竭。组织内MT含量的降低和MT mRNA表达的下调表明,组织细胞螯合镉的能力减弱,MDA含量显著升高表明在该阶段蟹体处于严重的氧化胁迫状态。另外,河南华溪蟹Vg基因序列长度为7764 bp,其中阅读框核苷酸序列为7701bp可编码2566个氨基酸；由生物进化树分析得知,河南华溪蟹与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)等蟹类在进化上亲缘关系较近而与虾类进化关系较远。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,该蛋白由分子量为102、84和70KD的3个亚基组成；溪蟹Vn-ELISA方法的工作浓度范围为125-2000ng/mL,定性检测的灵敏度可达到15.62 ng/mL。同时,卵巢中Vn含量的测定结果中各批次间不存在显著差异,且平均变异系数分别仅为7.81%,显示该法具有较高的稳定性和重复性。镉暴露引起卵巢组织卵母细胞直径的降低,同时肝胰腺和卵巢Vg-mRNA表达下调,组织内Vn含量的显著降低,与镉处理时间具有时间-效应和浓度-效应关系；经镉处理肝胰腺和卵巢组织内糖原及蛋白含量显著低于对照组的,其中在镉暴露15d谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性增强,表明镉处理后蟹体需要分解糖类、蛋白质等物质以满足能量的需求从而缓解镉的胁迫。由以上实验结果得出如下结论：第一,镉影响河南华溪蟹肝胰腺和卵巢内的脂肪积累；短期镉暴露可以诱导脂肪消化和脂肪合成代谢相关酶活性升高,促进脂类的消化、吸收和合成；长期镉暴露,显著影响脂肪消化、脂肪转运以及脂肪合成代谢等过程,进而阻碍了对体内脂肪的积累并最终影响肝胰腺和卵巢的发育。第二,短期镉处理促进了河南华溪蟹肝胰腺和卵巢细胞内的线粒体能量代谢,具体表现为应激反应。该反应有利于机体内脂肪酸的合成,并缓解脂质过氧化作用对细胞膜的损伤；但是,随着染毒时间的延长,河南华溪蟹组织细胞内的线粒体和内质网结构发生了改变,参与能量合成代谢关键酶的活性降低、能量合成相关基因mRNA表达受到抑制。表明镉阻碍了线粒体的呼吸链,最终影响了组织内的能量合成,并造成机体内ATP供应受阻。第三,短期镉处理,对河南华溪蟹组织内的NADPH合成有促进作用,诱导了细胞内还原力的生成。同时GSH合成速率升高,细胞内的抗氧化能力和抗镉胁迫能量加强；长期镉处理,则会抑制组织中还原力的生成,造成机体内还原型谷胱甘肽含量降低、抗氧化水平减弱,最终影响体内脂肪物质的生物合成。第四,镉抑制了河南华溪蟹肝胰腺和卵巢组织内Vg-mRNA的表达。通过自身代谢补偿机制导致糖类、脂肪等物质大量减少,引起组织内Vn积累量的降低,最终导致卵巢内卵母细胞直径降低。表明镉影响了卵母细胞的成熟并可能对卵子发生产生抑制作用。第五,本研究结果,可以作为深入研究河南华溪蟹生殖调控和镉污染毒性评估的重要理论依据。