水稻二化螟 Chilo suppressalis(Walker)属鳞翅目 Lepidoptera、螟蛾科 Pyralidae,是一种在我国从南到北广泛分布的重要钻蛀性害虫,严重危害水稻的安全生产。近年来在全球气候变暖的大背景下,水稻二化螟在我国一些水稻种植区有逐年加重为害的趋势。而之前我们的研究发现,水稻二化螟具有很强的温度耐受能力。因此,水稻二化螟温度耐受性机制的研究将从另一个侧面揭示其爆发成灾原因。目前对于水稻二化螟温度耐受性分子机制的研究主要集中在热激蛋白方面,但是水稻二化螟应对温度胁迫的机制仍然不清楚。因此,本研究从水稻二化螟的热休克转录因子蛋白和小分子量热激蛋白的调节机制出发,进一步揭示水稻二化螟温度耐受性的分子机制。主要研究结果如下:1.根据水稻二化螟的转录组数据,分离并克隆得到1种水稻二化螟热休克转录因子蛋白(HSF)和2种小分子量热激蛋白(sHSPs)基因的cDNA全长序列,分别命名为Cshsf,Cshsp22.9a和Cshsp23.9a。这三条基因全长分别为1532、838和840 bp,它们的开放阅读框长度分别为1014、603和627bp,分别编码337、200和208个氨基酸。基因组验证发现这三个基因均不含有内含子。CsHSF存在DBD、HR-A/B、HR-C和CTAD结构域,而CsHSP22.9a和CsHSP23.9a均拥有sHSPs家族特异性特征-α晶状体结构域。分子系统进化树分析发现:CsHSF与其他鳞翅目昆虫的HSF1亲缘性较低,表明CsHSF不属于常规的HSF1亚家族。CsHSP22.9a和CsHSP23.9a则与其他水稻二化螟的sHSPs聚为一支,表明它们具有较高的同源性。2.利用RT-qPCR技术分析了Cshsf,Cshsp22.9a和Cshsp23.9a的表达模式。结果发现:Cshsf在低温下抑制表达,在高温下随着温度的升高相对表达量先上升后下降;同时,Cshsp22.9a和Cshsp23.9a拥有相似的表达模式,都能够被高低温诱导表达,且在-11和42℃下相对表达水平最高。在42℃持续高温胁迫下,Cshsf的相对表达量从4 h开始显著上调表达,6 h后表达量最高,而Cshsp22.9a和Cshsp23.9a表现为持续地上调表达,表明这三种蛋白质的表达与温度有着密切的联系。3.利用pTYB12载体构建CsHSF重组蛋白原核表达质粒,利用Western Blot检测到重组蛋白CsHSF的存在。使用亲和几丁质结合标签介导的内含肽纯化系统体外大量分离纯化重组蛋白CsHSF,利用超滤膜浓缩后得到重组蛋白浓度为3.120mg/ml。利用GenomeWalker法分别扩增得到 Cshsp22.9a和Cshsp23.9a长度为-392-+47bp和-599-+28bp的启动子序列,利用JASPAR在线工具分析序列发现在Cshsp22.9a和Cshsp23.9a启动子序列中分别存在3个和1个HSEs。最后利用凝胶迁移实验EMSA验证CsHSF与Cshsp22.9a和Cshsp23.9a启动子序列的体外结合情况,综合分析显示,CsHSF均能够与Cshsp22.9a和Cshsp23.9a的启动子序列结合。4.利用RNAi技术成功沉默了水稻二化螟Cshsf基因的表达,同时检测了干扰Cshsf后Cshsp22.9a和Cshsp23.9a在适温(27℃)和高温胁迫(42℃)下的表达情况。结果显示:在27℃和42℃下,Cshsf表达量的沉默效率分别为77.42%和63.42%。干扰Cshsf后,Cshsp22.9a在27℃条件下的相对表达量显著上调,Cshsp23.9a的表达量无显著变化,而在高温胁迫下,Cshsp22.9a的表达与对照相比没有显著差异,Cshsp23.9a的表达水平却显著下调。此外,还发现干扰后的水稻二化螟在高温下的存活率显著低于对照组,为63.3%。结果表明,Cshsf与水稻二化螟的温度耐受性有关,同时CsHSF功能的缺失会对Cshsps的表达产生显著的影响。