釉丛蛋白(tuftelin)是牙釉质基质蛋白的一种，完整的蛋白有390个氨基酸，分子量为44.3kDa，富含谷氨酸和天门冬氨酸。牙釉质的发育是由成釉细胞所分泌的釉质基质蛋白不断地降解并被矿物质取代，最后形成全身硬度最高的组织。因此，对釉基质蛋白的研究也就成为矿化研究领域中的热点。tuftelin在牙釉质基质蛋白中含量虽然不多，但根据它在釉质基质蛋白中出现最早，以及本身酸性的、亲水的、具有很强的结合钙离子的能力的特点，推断它可能启动釉质的矿化。因此，研究tuftelin对探讨牙釉质发育的调控具有十分重要的意义。本实验对tuftelin进行了cDNA克隆，原核表达、制备抗体、和不同组织的检测共四个部分的研究，为进一步的功能研究奠定了基础。 一、tuftelin的基因克隆 克隆tuftelin成熟肽编码区基因片段：以小鼠牙乳头组织中抽提的总RNA为模板，用Oligo(dt)作引物，逆转录合成牙乳头cDNA，然后利用RT-PCR法，从cDNA中扩增出tuftelin基因片段(约1.2kbp)，将所得基因片段插入pBluescript质粒载体，转化到大肠杆菌XL-1-Blue后挑选阳性克隆，提取重组质粒DNA。通过酶切分析和核苷酸序列分析对阳性克隆的鉴定， 第四军医大学硕士学位论文 结果表明克隆到的是一个比Macdongall 1998年所报道的序列少第二外显子 的转录本，证明了tUftelin剪接模式的多样性。 H、tuftelin表达、多抗制备和检测 用酶切、连接的方法将己克隆至 pBluescript KS＋载体中的 tuftelin cDNA 片段（编码 365个氨基酸）用 T4 DNA连接酶连入载体 pPROEX“HTC中， 转化大肠杆菌，WTG诱导。收集菌体，裂解后SDS－PAGE 电泳，表达出分 子量42kD的融合蛋白，与预期一致。割胶后免疫新西兰大白兔，制备抗体。 8周以后，Weste。检测抗原抗体特异性及抗体效价达 1：100000。认为成功 地表达出tuftelin并制备出了高效价多克隆抗体。 三、tuftelin真核表达载体的构建和真核细胞转染 用原核系统表达的蛋白缺乏翻译后修饰，缺少真核生物体内蛋白的折 叠、糖基化等特点，所以原核系统表达的目的蛋白常常不具备天然蛋白的功 能。Tuflelin是高度糖基化的糖蛋白，因此选择真核表达系统所产生的蛋白 来研究其功能是最理想的方法。本研究将tuftelin全长基因克隆入真核表达 载体PcDNA3中，构建PcDNA3－tuftelin重组质粒。酶切鉴定和测序正确后， 将pcDNA3－tuftelin真核表达质粒转染COSJ细胞，Western七lot证明tuflelin 在COS－7细胞中得到了较高表达，为其功能研究打下了基础。 四、组织表达研究 用Western七＊法检测不同组织的表达情况，结果显示tuftelin在小鼠牙 胚中有表达，分子量约为42kD左右，其它软组织（包括心、肾、脾、肾） 同样有表达。这与前人的实验一致。提示tuftelin可能还具有其它的生物功 gg。 Tuftelin的克隆、蛋白表达、抗体制备以及组织学分布的研究为进一步 深入研究tUftelin的结构和功能、揭示牙釉质矿化机制打下了基础。