Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1铁吸收调节蛋白fur-like基因克隆及功能分析

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趋磁细菌是一类能在胞内合成纳米磁小体的原核微生物。探讨其大量培养条件、磁小体合成机制以及磁小体的应用策略,成为目前人们关注的热点。趋磁细菌胞内铁元素含量最高可达3%,超过非磁细菌(如:E.coli)的100倍。它们具有高效的铁吸收系统和适宜的调控机制,既能够保证细胞主动吸收大量的铁离子又能有效地限制铁离子的毒副作用,保证细胞正常的生长和代谢。铁吸收调控蛋白(Fur)是铁代谢的全局调控因子,研究趋磁细菌的fur基因,对阐明铁吸收和磁小体合成机制具有重要意义。 本文以Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1材料,采用λEMBL3和柯斯质粒pKC505为载体,构建了MSR-1的两个基因组文库。以趋磁螺菌M.magnetotacticum MS-1中推测的fur序列做探针(DIG-Mmfur),从文库中钓出含有MSR-1 fur 基因的3633bp片段,经测序并在NCBI中比对发现,该片段含有4个ORFs。其中,ORF2长度为420bp,是编码139个氨基酸的fur。其上游是一个编码406个氨基酸的2,2’-硝基丙烷双加氧酶(2-nitropropane di-oxygenase,NPD)的基因,下游编码2个未知蛋白的序列。经分析显示,Fur含有一个H-H-D-H保守结构域和一个保守的金属离子结合位点。对蛋白高级结构预测表明:尽管该蛋白与已知Pseudomonas aeruginosa的Fur氨基酸同源性只有27.3%,但二者N-端结构在空间构型上极为相似,该结构是与DNA结合的区域;C-端则差异较大。将MSR-1的fur基因在体外表达成功,发现其虽然可以与大肠杆菌Fur-box结合,但在功能上不能互补大肠杆菌的fur突变体。 为进一步分析Fur的功能,构建了自杀载体(fur::kan),经同源重组双交换获得Mgryphiswaldense fur,突变体(DFH-1)。电镜观察显示,DFH-1丧失合成磁小体的能力,而胞内聚β-羟基丁酸(PHB)颗粒有所增加。原子吸收光谱分析表明:无论是在含低铁还是高铁的培养基中,DFH-1胞内铁含量始终维持在0.037%的水平,低于野生型菌株10倍以上;DFH-1的生长可以耐受1 mM H<,2>O<,2>,比野生型耐受H<,2>O<,2>的能力增加了5倍。 本文首次克隆了趋磁螺菌MSR-1的fur基因并分析了它的功能。研究结果证明:趋磁螺菌与非磁细菌的Fur蛋白的C-端结构上存在显著差异,导致它们的功能有所不同。MSR-1的fur基因突变,削弱了细胞对铁的吸收,不能合成磁小体。推测MSR-1的Fur的功能与非磁细菌不同,为细胞铁吸收的正调控因子。fur突变体胞内铁含量降低但对H<,2>O<,2>耐受性增强和环境中一定浓度的铁(20μM以上)和低氧条件,有利于促进趋磁螺菌细胞生长和磁小体合成的事实说明,Fur在趋磁细菌细胞内对铁和氧代谢的调控是偶联的。
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