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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS,Porcine Reproductive and Respiration Syndrome)的病原体是单股正链RNA病毒—猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV,PRRS Virus),能够引起母猪繁殖障碍及仔猪呼吸道疾病。PRRS因其具有高致病性、高传染率、高死亡率的特点,对我国及至世界的养猪业造成巨大的经济损失;又由于PRRSV感染后导致宿主免疫抑制进而出现的伴随感染以及亚临床症状,对防治猪繁殖与呼吸综合征工作带来了很多不利因素;PRRSV还具有高变异、抗体依赖性等特征,目前疫苗及药物还不能有效地控制该病。此外,由于大量死亡猪、药物残留造成的生态环境破坏及家畜肉类产品安全隐患。因此,研究和阐明PRRSV与宿主的相互作用、免疫抗病等机制,将为培育抗病新品种(系)提供基因或分子靶点资源。线粒体不仅是细胞内重要的能量器官,线粒体还是重要的天然免疫场所,对获得性免疫存在不可忽视的调控作用。为维持线粒体网络的稳态,细胞内的线粒体既不断发生分裂与融合,同时还通过线粒体自噬来清除功能受损的线粒体。近年来的研究发现线粒体动态(融合与分裂)在线粒体介导的天然免疫过程中发挥至关重要的作用,线粒体融合能够促进天然免疫反应而线粒体分裂能够抑制天然免疫反应。因此许多病毒以线粒体为靶标进化出不同的策略来逃避天然免疫反应。然而,线粒体动态与线粒体自噬关键蛋白对PRRSV感染的作用及机理还不甚清楚。故本研究对线粒体动态与线粒体自噬关键蛋白在抵抗PRRSV的感染中的作用及机制进行了研究。主要研究结果如下:1、Drp1蛋白在PRRSV感染后在Ser616位点发生磷酸化并转位到线粒体介导线粒体分裂的发生。以Marc145细胞为模式细胞研究PRRSV感染引起的细胞反应。通过透射电镜和共聚焦显微镜分析在PRRSV感染前后细胞内线粒体的形态变化。PRRSV感染能够引起细胞内线粒体形态由长线状转变为小而圆的颗粒状,并且线粒体嵴出现明显肿胀。表明PRRSV感染能够引起细胞内线粒体形态发生较大的改变,即引起线粒体分裂。为了进一步揭示PRRSV感染引起线粒体形态改变(分裂)的分子机制,对线粒体分裂因子Drp1的表达与定位进行了检测。通过利用Western Bloting、共聚焦显微镜技术以及亚细胞分离技术,检测结果发现线粒体分裂因子Drp1在PRRSV感染后其Ser616位点发生磷酸化,且Ser616磷酸化的Drp1能够从胞质转移到线粒体表面,从而介导线粒体分裂的发生。这些结果表明PRRSV感染能够引起宿主细胞Drp1依赖的线粒体分裂过程。2、抑制线粒体分裂关键蛋白Drp1通过促进细胞凋亡抑制PRRSV感染。线粒体与细胞凋亡、天然和获得性免疫以及病毒感染之间存在密切的联系。本研究发现干扰Drp1介导的线粒体分裂抑制PRRSV病毒的感染,而这种抑制作用是通过促进被感染细胞凋亡实现的。si RNA干扰Drp1表达抑制Drp1介导的线粒体分裂后PRRSV在细胞内的感染也受到显著的抑制;进一步的研究发现干扰Drp1表达显著地提高细胞内的cleaved-Caspase3和cleaved-PARP表达,且Caspase3的活性也显著高于对照组。因此推测PRRSV感染引起的Drp1依赖的线粒体分裂是通过抑制细胞凋亡而为PRRSV赢得更长时间在宿主细胞中感染。3.PRRSV感染引起宿主细胞线粒体自噬而降低线粒体DNA拷贝数及线粒体质量。线粒体动态与线粒体质量存在密切联系。PRRSV感染改变线粒体动态,是否能够改变线粒体质量?采用q PCR和Western Blotting技术分别对线粒体质量进行检测。结果发现PRRSV感染后线粒体DNA拷贝数随着病毒感染时间的延长而降低;对线粒体标志蛋白Tom20的检测表明线粒体质量在PRRSV感染后也显著降低,并且随着感染时间的延长而加深。通过干扰线粒体自噬相关蛋白Parkin抑制线粒体自噬的情况下,PRRSV引起的线粒体DNA拷贝数降低被挽救,表明PRRSV引起的线粒体DNA拷贝数降低是由于病毒感染引起的线粒体自噬导致的。4、Parkin在PRRSV感染后发生线粒体转位并介导线粒体自噬。细胞内多余或功能缺失的线粒体主要通过线粒体自噬的方式被清除。此前包括本实验室在内已经发表多篇论文表明PRRSV感染能够引起细胞自噬的发生。本研究电镜分析显示PRRSV感染能够引起宿主细胞线粒体肿胀,嵴受损。那么这种异常的线粒体是否能够通过线粒体自噬的方式被降解并未见报道。因此利用q PCR、Western Blotting技术以及共聚焦等技术对PRRSV感染不同时间线粒体自噬分子的表达及定位情况进行分析。结果发现线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin在PRRSV感染后大量表达。此外从分离出的线粒体中也检测到Parkin的聚集。而在干扰Parkin时自噬相关蛋白LC3II在线粒体的聚集也相应的降低。因此PRRSV感染能够引起宿主细胞PINK1/Parkin依赖的线粒体自噬过程。那么PRRSV是否能够引起完整的线粒体自噬呢,通过构建定位于线粒体的双荧光载体,利用共聚焦显微镜技术检测发现PRRSV感染后红色荧光显著提高,而在对照组细胞则呈黄色荧光,表明PRRSV感染能够引起完整的线粒体自噬过程。5、抑制线粒体自噬关键蛋白Parkin能够通过促进细胞凋亡而抑制PRRSV的感染。包括本实验室在内已发表的文献表明PRRSV能够劫持细胞自噬促进自身感染,且其它多种RNA病毒感染引起的的宿主细胞线粒体自噬也能够促进其自身的感染。为了探讨PRRSV诱导的线粒体自噬在抗PRRSV感染中的作用机制,本研究利用si RNA以干扰Parkin的表达,进一步研究抑制Parkin依赖的线粒体自噬时病毒的感染情况,结果表明在抑制Parkin依赖的线粒体自噬时PRRSV的感染也受到严重的阻抑。进一步对细胞凋亡蛋白cleaved-PARP、cleaved-Caspase3表达进行检测,发现干扰Parkin表达对细胞活性没有显著影响,但显著加强了病毒感染诱导的细胞凋亡水平。因此推测Parkin介导的线粒体自噬通过抑制细胞凋亡反而促进PRRSV在宿主细胞内的感染。