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林麝（Forest musk deer,FMD）是隶属于偶蹄目、麝科、麝属的反刍动物,为国家一级保护动物。野生林麝曾遭受到过度捕杀,同时,伴随着栖息生境的破坏,野生林麝种群数量曾急剧下降。我国从1958年开始人工养殖林麝,虽历经半个多世纪,其发展速度仍比较缓慢。肺炎是人工养殖林麝中最常见的呼吸系统疾病,是阻碍林麝养殖业健康发展的重要因素之一。大量研究表明,细菌性感染是引发林麝患肺炎的主要原因。目前,对于林麝细菌性肺炎的研究主要集中在病原菌的分离鉴定,其发病机理研究还有待深入。循环micro RNA（Circulating mi RNA）作为一种重要的生物分子,其可从患病肺组织细胞主动分泌进入体液循环,是一种细胞间的通讯方式,能携带信息在不同细胞、组织与器官之间传递,在分子病因和治疗靶点的研究中取得了一系列的成果。林麝是国家一级保护动物,不能采集健康肺脏样品,这给林麝细菌性肺炎的研究带来了困难。因此,本研究拟通过高通量测序,对患细菌性肺炎林麝血液循环mi RNA表达谱进行分析,并结合构建的林麝肺源病原菌介导的细菌性肺炎大鼠模型,筛选出林麝细菌性肺炎相关mi RNA。最后,对林麝肺成纤维细胞进行体外培养,并基于该细胞对筛选的林麝细菌性肺炎相关mi RNA作用机制进行研究。主要研究内容和试验结果如下:（1）对5只死亡林麝进行剖检可见,林麝部分肺脏组织出血、肺脏与胸腔内壁发生粘连,且出现胶胨样或豆腐渣样渗出。在5只林麝肺脏中分别分离出了铜绿假单胞菌2株、肺炎克雷伯氏菌1株、马腺疫链球菌1株和化脓隐秘杆菌1株;HE染色结果显示,林麝肺脏组织出现胸膜增厚,支气管管腔、肺泡腔内或间质内出现浆液-纤维素性物质渗出、肺脏局部肺泡萎陷、肺泡上皮细胞脱落和坏死、肺泡壁充血、成纤维细胞增生等病理改变,同时,也出现炎症细胞的浸润;Masson染色和天狼星红染色结果显示,林麝肺脏出现大量胶原蛋白和纤维蛋白渗出,表明林麝肺脏发生了细菌性感染,并伴随着组织纤维化;通过对血液循环mi RNA表达谱进行分析发现,5只患细菌性肺炎林麝血液中4个mi RNA表达量降低（mi R-30g、let-7f-5p、mi R-27d-3p和mi R-25-3p）,5个mi RNA表达量增加（mi R-142-5p、mi R-451-3p、mi R-652、mi R-9-5p和mi R-206）（p＜0.05）;差异表达mi RNA靶基因KEGG功能分析发现,有99个靶基因参与到了细胞外基质受体相互作用（ECM-receptor interaction）和粘着斑（Focal adhesion）通路中,这两个通路与细胞外基质渗出密切相关,是肺脏发生纤维化的重要调控通路。RT-q PCR分析显示,mi R-30g、let-7f-5p、mi R-27d-3p、mi R-25-3p和mi R-652 5个差异表达mi RNA在患细菌性肺炎林麝血液中表达趋势与测序结果相一致。（2）为进一步对林麝细菌性肺炎相关mi RNA进行挖掘,我们利用分离的林麝肺源肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌和马腺疫链球菌,通过滴鼻感染,构建林麝肺源致病菌细菌性肺炎大鼠模型。结果显示,三种林麝肺源致病菌能够引起大鼠肺重比增加;大鼠肺脏HE染色结果显示,试验组大鼠部分肺泡上皮细胞脱落、肺泡壁塌陷、肺间质大量纤维组织增生、大量成纤维细胞、纤维细胞和纤维样物质渗出,同时伴有炎性细胞浸润等病理变化;Masson染色和天狼星红染色结果显示,三个试验组大鼠肺脏胶原蛋白和纤维蛋白渗出增加;大鼠肺脏促纤维化因子TGF-β1和TNF-α表达量分析显示,三个试验组大鼠肺脏组织中TGF-β1和TNF-α基因的表达量增加。结合病理组织学观察和促纤维化基因表达分析,试验组大鼠肺脏发生纤维化;对大鼠血液和肺脏中的林麝细菌性肺炎相关mi RNA进行RT-q PCR分析发现,let-7f-5p和mi R-652两个mi RNA在林麝血液、大鼠血液和肺脏中表达趋势相一致,其中,let-7f-5p在患细菌性肺炎林麝和大鼠样品中表达量均降低（p＜0.01）。通过RT-q PCR和Western Blotting分析,我们进一步发现let-7f-5p靶基因中PIK3CA作为重要组分的PI3K/Akt/COX2信号通路在试验组大鼠肺脏组织中被激活,表明let-7f-5p和PI3K/Akt/COX2信号通路与林麝肺源致病菌介导的细菌性肺炎之间存在相关性。（3）为了对let-7f-5p与靶基因PIK3CA之间的靶向关系进行验证,我们首先对let-7f-5p核苷酸序列在不同物种之间的保守性以及与PIK3CA 3’UTR之间的互补关系进行分析,结果显示,let-7f-5p序列在人、大鼠、牛、兔、林麝等多个物种之间高度保守,且在人、大鼠和林麝三个物种中let-7f-5p成熟序列均位于其前体（pre-let-7f-5p）茎环结构的5’臂上。同时,在不同物种中,let-7f-5p种子序列与其靶基因PIK3CA 3’-UTR之间完全互补。随后,我们构建了let-7f-5p靶基因PIK3CA 3’UTR野生型（PIK3CA-WT）和突变型（PIK3CA-MUT）双荧光素酶重组载体。双荧光素酶报告基因实验结果显示,在PIK3CA野生型重组质粒组中,与转染let-7f-5p inhibitor相比,过表达let-7f-5p能够显著降低海肾荧光素酶的表达量（p＜0.05）,而在PIK3CA突变型重组质粒组中,海肾荧光素酶的表达量不受let-7f-5p过表达或抑制的影响。该结果进一步证实了let-7f-5p与PIK3CA基因之间具有靶向调控关系。（4）为探究let-7f-5p对PI3K/Akt/COX2信号通路的影响,我们通过采用机械分离和胰蛋白酶冷消化对林麝肺脏组织细胞进行处理后,结合差速贴壁法纯化处理后,对林麝肺脏成纤维细胞进行传代培养,并对其进行了一系列生物学特性的研究。结果显示,采集的林麝肺脏组织在胰酶处理过程中能够看到明显的纤毛摆动,原代培养的细胞主要以成纤维细胞样细胞和上皮细胞样细胞为主。经差速贴壁培养的传代林麝肺细胞呈现出典型的纤维状和长纺锤状形态,且细胞折光性强、胞质饱满、核质清晰;微生物培养、DAPI染色以及透射电镜观察均显示林麝肺细胞无微生物污染;生长曲线为典型的“S”型;波形蛋白、角蛋白免疫荧光鉴定显示,培养的细胞波形蛋白呈阳性表达,角蛋白呈阴性表达,表明传代培养的细胞为肺成纤维细胞;核型分型显示,林麝肺成纤维细胞染色体为58条,未出现染色体异倍化。将最佳浓度的let-7f-5p mimics转染林麝肺成纤维细胞后,RT-q PCR分析表明,PI3K/Akt/COX2信号通路基因（PIK3CA、Akt1、PDK1、IKBKA、NF-κB1和COX2）表达量发生下调。同时,基于编码林麝pri-let-7f-5p的DNA序列,我们构建了过表达let-7f-5p重组腺相关病毒rp AAV-CMV-e GFP-pri-let-7f-5p表达载体,经过体外包装,获得过表达let-7f-5p重组腺相关病毒r AAV-let-7f-5p,同时设置空载体p AAV-CMV-e GFP作为对照,获得腺相关病毒AAV。最后,将包装的r AAV-let-7f-5p病毒和AAV病毒分别感染林麝肺成纤维细胞,并对let-7f-5p和PI3K/Akt/COX2信号通路基因在林麝肺成纤维细胞中的表达量进行分析。结果表明,在林麝肺成纤维细胞中,过表达let-7f-5p能够抑制PI3K/Akt/COX2信号通路的活性。综上所述,通过细菌性肺炎林麝血液循环mi RNA测序、细菌性肺炎大鼠模型试验,我们完成对林麝细菌性肺炎相关mi RNA和相关信号通路的挖掘,即let-7f-5p和PI3K/Akt/COX2信号通路与林麝细菌性肺炎之间存在相关性。而双荧光素酶报告基因实验完成了let-7f-5p与PIK3CA基因之间的靶向关系验证。最后,林麝肺成纤维细胞体外试验以及let-7f-5p在林麝肺成纤维细胞中的过表达试验表明,在林麝肺成纤维细胞内,let-7f-5p能够对PI3K/Akt/COX2信号通路的活性进行调节。本研究为林麝细菌性肺炎的发病机制研究奠定重要基础。