近年来,寻找合适的支架材料和方法构建组织工程化血管一直是血管组织工程领域中研究报道的焦点。目前构建组织工程化血管面临着这样的问题：支架材料难于满足既有足够的力学性能又有良好生物相容性的要求；内皮细胞层粘附不牢固而脱落导致血栓的形成。为此,本研究论文采用宿主自身腹腔内形成的活组织管作为支架材料,将血管内皮细胞接种在活组织管腔内,在自主研制的生物反应器内逐步增加流体剪切力以形成单层融合耐剪切的内皮细胞层。 用0.1％浓度的胶原酶作为消化液,消化时间为20分钟,消化温度为37℃,成功分离狗颈总静脉内皮细胞并进行体外扩增培养。血管内皮细胞的生长曲线为典型的S形。血管内皮细胞培养瓶内显微镜下观察呈现特征性的鹅卵石样形态。细胞经Ⅷ因子相关抗原检测,呈阳性反应,证明是血管内皮细胞。 将无菌的医用硅橡胶管埋入狗的腹腔后,三周的时间异物炎症反应形成纤维包囊管材(活组织管)。材料的力学性能测试结果显示断裂拉伸强度为4.7±2.3MPa,断裂伸长率为34.2±8.3％,爆破强度为1100±187mmHg,缝合耐受强度为2.5±0.3牛顿。活组织管经Masson染色显示波浪状排列的胶原纤维,呈类同心圆样结构,其间可见染为红色的平滑肌样细胞。扫描电子显微镜结果显示,管腔内表面大量纤维状及膜状的细胞外基质成分,基质下可见细胞胞体及纤维样突起。天狼星红染色结果显示活组织管主要由Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维构成。免疫组化染色研究结果显示,管壁均含有大量的α-smooth muscle actin阳性细胞。 我们在TH-1200人造心瓣膜脉动流检测装置的基础上设计制造了能够模拟人体小口径血管脉动流的小口径血管组织工程生物反应器。此生物反应器采用直线电机作为动力驱动装置。从成年人身上采集的左心室容积变化信号经过直流功率放大器放大后驱动直线电机,从而驱动模拟左心室的硅橡胶囊按照近似人体生理左心室容积变化规律而收缩舒张,通过后负荷的调节产生近似人体小口径血管脉动流。特殊设计的旋转培养室可以进行细胞的二次接种,并且可以使旋转接种和脉动培养连续进行。 活组织管在生物反应器里进行旋转接种血管内皮细胞,分两次接种,每次接种时间为3.5小时,转速为5-8转/小时。细胞接种密度达到3.47±0.07×105cells/cm2。内皮细胞经过静态培养两天后,马上施加类似人体血管动脉的高剪切力15.3±4.6dynes/cm2,55±20/100±20 mmHg作用下动态培养3天。虽然能观察到拉长的细胞形态和细胞的取向排列,但是细胞并没有铺满整个内腔面。在大多数地方的内皮细胞被高剪切流体冲走了。这样的结果显示,马上施加的高剪切力流体冲走了大量的内皮细胞,血管内皮细胞还没有形成牢固的细胞与细胞和细胞与基质之间的连接。当流体剪切力逐步从1.5±0.8dynes/cm2,55±20/100±20 mmHg增加到15.3±4.6dynes/cm2,55±20/100±20mmHg作用下,可以观察到血管内皮细胞形态拉长,并且顺着流体前进方向取向排列。经过2天的静态培养和7天的动态培养,在活组织管内腔面形成了融合单层的内皮细胞层,内皮细胞覆盖着整个腔面,细胞与细胞之间形成了紧密连接。最终在体外构建了具有足够力学强度和单层融合耐剪切内皮细胞的小口径组织工程血管。