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核糖体蛋白参与蛋白质合成,但在其他细胞活动中的功能,如信号传导途径、花的发育和自交不亲和反应等,尚待进一步研究。在两性被子植物中,雄蕊和柱头彼此靠近,增加了自交的机会。为了避免自交,开花植物已独立进化出防止自交和促进异交的自交不亲和系统,这能够增加杂种活力和遗传变异。在甘蓝型油菜中,花粉分泌的配体富含小半胱氨酸蛋白SCR/SP11(S-locus cysteine-rich/S-locus protein 11)与柱头S位点受体激酶SRK(S-locus receptor protein kinase)特异性相互作用,诱导自交不亲和反应发生。二者之间的相互激活具有E3泛素化功能的ARC1(Armadillo repeat-containing 1),活化的ARC1能够使受精所需的蛋白泛素化后降解。虽然ARC1介导的泛素化降解亲和因子EXO70A1、GLO1和PLD1途径已经得到充分证明,但自交不亲和反应可能比想象的更为复杂,或包含多个平行途径而不仅仅是受ARC1调控。在本研究中,甘蓝型油菜不同授粉处理后,通过时空表达转录组结合q RT-PCR分析,我们鉴定到一组表达模式独特的核糖体大亚基蛋白基因(RPLS)。同时,我们也分析了这些RPLS的理化性质、全基因组分布和进化关系。CRISPR/Cas9编辑一个RPLS基因Bna RPLS34,突变体能够打破自交不亲和反应,暗示该基因参与甘蓝型油菜自交不亲和反应。总之,我们的研究结果表明,Bna RPLS34可能是自交不亲和反应的重要功能基因,将是一个新的自交不亲和正向调控基因。研究结果如下:1、甘蓝型油菜RPLS的全基因组分析基于拟南芥TAIR数据库,通过生物信息学分析发现,核糖体蛋白属于一个超级家族,即“细胞质核糖体蛋白基因家族”(Cytoplasmic ribosomal protein gene family,CRPG)。CRPG家族包含核糖体大亚基蛋白(Ribosomal proteins larger subunit,RPLSs)和核糖体小亚基蛋白(Ribosomal proteins smaller subunit,RPSSs)。因为我们只对RPLSs感兴趣,所以我们提取所有相应的基因,共得到123个基因。以123个拟南芥RPLSs基因为参考序列,搜索白菜、甘蓝和甘蓝型油菜基因组数据库,共鉴定到522个Bna RPLSs,269个Bra RPLSs和257个Bol RPLSs基因。与拟南芥、白菜和甘蓝相比,甘蓝型油菜拥有更多的RPLSs基因,这是因为甘蓝型油菜是异源四倍体。为了简化分析,我们首先聚类分析了拟南芥和甘蓝型油菜的RPLSs基因,移除所有重复和比对不好的序列都。因为Bna RPLS34是研究的目标基因,所以我们选择它所在的一个分支进行分析。以目标分支的所有基因为参考,在白菜和甘蓝中进行同源基因搜索,共69个基因被分为四个分支,分别为L13、L29、L34和L36。该分支的命名与每个分支成员共有的结构域一致。在同一个分支中,鉴定到27个Bna RPLSs基因。有趣的是,转录组结合q RT-PCR分析表明,这27个基因在甘蓝型油菜的自交不亲和反应中具有相同的高表达模式,而在自交亲和反应中则为低表达。2、Bna RPLSs基因的表达分析通过系统发育分析,我们鉴定到27个Bna RPLSs基因,且它们在甘蓝型油菜亲和/不亲和反应中具有相同的表达模式。通过q RT-PCR分析也证明了它们具有相同的表达模式,且在自交不亲和授粉2-30min内始终保持着较高的表达量,30min时达到最高,在亲和授粉中的表达量一直较低,推测核糖体大亚基基因在甘蓝型油菜自交不亲和反应中发挥重要作用。3、Bna RPLS34的功能分析目前,植物核糖体蛋白功能的报道,主要集中在蛋白质合成、细胞生长、分裂和发育等,有关它们是否调控自交不亲和反应还没有研究。通过CRISPR/Cas9技术,我们构建了Bna RPLS34基因的突变体,完全打破了甘蓝型油菜的自交不亲和性。q PCR分析发现,Bna RPLS34突变体与野生型相比,自交不亲和正向调控基因SRK和ARC1受到显著抑制,而THL1/2、EXO70A1和GLO1发生显著上调表达。基于以上研究,我们可以认为Bna RPLS34是正向调控甘蓝型油菜自交不亲和性的候选基因,阐明其分子机制有助于丰富芸薹属植物自交不亲和反应的信号转导途径。