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细胞自噬(大自噬,macroautophagy)是真核细胞中普遍存在的自我吞噬的现象,研究表明自噬在进化上高度保守,从酵母、果蝇到哺乳动物中都能找到自噬相关的同源蛋白。自噬的发生需要多种自噬相关蛋白(autophagy related protein,ATG)的参与,哺乳动物中报道某些ATG与脂代谢之间有着紧密的关系,激活调控噬脂发生的上游信号或是Atg基因的遗传操作都可以诱导自噬的发生进而降解脂肪。目前,昆虫中尚无细胞自噬与脂代谢关系的研究报道,我们在家蚕中的前期研究发现:BmAtg1 RNAi后,脂肪体中的脂肪降解受阻,但具体机制不详。此外,细胞自噬的分子机制还未被完全阐明且其与脂代谢之间相互作用的机制也并未在昆虫中得到完全解析。因此,本论文将利用RNA干扰、sgRNA和Cas9 mRNA显微注射等方法研究Atg基因对脂代谢的影响。同时构建UAS/GAL4和CRISPR/Cas9的转基因载体,尝试初步建立稳定遗传的转基因阳性品系,为进一步深入研究昆虫细胞自噬与脂代谢的关系提供基础。本研究主要获得如下初步结果:1.家蚕ATG蛋白的生物信息学分析通过生物信息学软件对家蚕关键ATG蛋白进行分析显示:BmATG1属于不稳定蛋白且没有跨膜区,有一个蛋白激酶结构域。BmATG5、BmATG6均属于不稳定蛋白且没有跨膜区,没有对应的功能结构域。BmATG8属于稳定蛋白,在第75-100个氨基酸之间为跨膜区,可能是跨膜蛋白,整体是一个类泛素化的结构域。BmATG13属于稳定蛋白,第120-140个氨基酸之间为跨膜区,可能是跨膜蛋白,有一个HORMA结构域。2.RNA干扰家蚕Atg基因降低脂肪体细胞自噬、导致脂滴堆积及变态发育异常家蚕游走前12h,活体注射家蚕BmAtg1、BmAtg5、BmAtg6、BmAtg8、BmAtg13基因的dsRNA到蚕体中,正常饲养24h后,取其脂肪体进行Lyso-tracker Red、TEM等检测细胞自噬。结果显示RNA干扰Atg基因后脂肪体细胞自噬和酸性溶酶体数量大幅下降,同时脂肪体中脂肪的降解受阻,出现脂滴堆积,检测发现脂肪体中甘油三酯含量增多,而血淋巴中甘油二脂含量下降。进而导致家蚕变态发育异常,且在不同发育时期出现死亡,预蛹时期个体死亡数量最多。3.CRISPR/Cas9敲除Atg基因后降低脂肪体细胞自噬发生并导致脂滴累积设计合成家蚕BmAtg1、BmAtg5、BmAtg6、BmAtg8、BmAtg13基因的sgRNA和Cas9 mRNA一起混合注射进蚕卵,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对上述基因进行敲除。待家蚕卵孵化后饲养至Early wandering时期,取其脂肪体,进行Lyso-tracker Red、TEM检测细胞自噬以及BODIPY染色观察中性脂滴变化,实验结果表明,敲除Atg基因后脂肪体细胞酸性溶酶体的数量大幅降低,自噬溶酶体的形成严重受阻,脂肪体内脂滴发生积累,表明Cas9敲除Atg基因后下调了家蚕脂肪体的细胞自噬水平,导致脂肪体中脂肪的降解发生异常;同时检测发现不论是家蚕雌蛹还是雄蛹,在自噬相关Atg基因敲除后重量都较对照高,提示敲除家蚕Atg基因后脂肪体中脂肪降解受阻导致蚕蛹重量增加。4.初步建立UAS/GAL4超表达和CRISPR/Cas9敲除的稳定遗传操作品系通过构建UAS/GAL4双元超表达系统和CRISPR/Cas9基因编辑敲除系统中所用的重组载体,进行显微注射,筛选转基因阳性个体,建立稳定的转基因家蚕品系。成功构建的重组载体如下:用于UAS/GAL4系统的7个载体:pBac[3×p3EGFP,Hsp70promoter-GAL4]、pBac[3×p3EGFP,LP3promoter-GAL4]、pBac[3×p3DsRed,UAS-BmAtg1]、pBac[3×p3DsRed,UAS-BmAtg5]、pBac[3×p3DsRed,UAS-BmAtg6]、pBac[3×p3DsRed,UAS-BmAtg8]、pBac[3×p3DsRed,UAS-BmAtg13]。用于CRISPR/Cas9系统的7个载体:pBac[3×p3DsRed,Hsp70-Cas9]、pBac[3×p3DsRed,LP3-Cas9]、pBac[3×p3EGFP,BmAtg1sgRNA]、pBac[3×p3EGFP,BmAtg5sgRNA]、pBac[3×p3EGFP,BmAtg6sgRNA]、pBac[3×p3EGFP,BmAtg8sgRNA]、pBac[3×p3EGFP,BmAtg13sgRNA]。将构建好的UAS/GAL4系统重组载体质粒和CRISPR/Cas9系统重组载体质粒分别与Helper辅助质粒混合后进行显微注射,注射后的蚕卵正常饲养至化蛾,记为G0代,将G0代中注射相同外源基因的雌雄蛾进行交配产卵,记为G1代,将G1代进行荧光筛选,得到5个阳性转基因品系,其中CRISPR/Cas9系统获得阳性转基因品系为pBac[3×p3DsRed,LP3-Cas9],UAS/GAL4系统获得的阳性转基因品系为pBac[3×P3DsRed,UAS-BmAtg5]、pBac[3×P3DsRed,UAS-BmAtg6]、pBac[3×P3DsRed,UAS-BmAtg8]、pBac[3×P3DsRed,UAS-BmAtg13]。