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骨骼肌是动物机体必不可少的组织,是产肉量及肉品质的重要研究对象。骨骼肌中的肌纤维是由多个单核成肌细胞融合而成的,此过程称为肌生成。成肌细胞经过增殖、分化融合成多核肌管,此过程受包括Myo D、Myf5、Myo G和MRF4在内的肌源性调节因子(MRFs)以及非编码RNA(non-coding RNA,nc RNA)的调控。环状RNA(circular RNA,circRNA)是普遍存在于各种生物体中的内源性非编码RNA,能够调节真核生物的基因表达。近年来,关于circRNA的研究受到广泛关注,有关研究表明circRNA参与调节肌生成过程,其重要性不容忽视。因此,本研究通过本实验室前期秦川牛骨骼肌circRNA测序数据,筛选到在胎牛和成年牛肌肉组织中差异表达的环状RNA circTTN,利用过表达和干扰技术、实时荧光定量PCR(RT-q PCR)、细胞免疫荧光、Ed U、CCK-8、流式细胞术、双荧光素酶报告分析、RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)、免疫印迹实验(Western Blot)等技术系统深入地研究了circTTN对牛成肌细胞增殖、分化的影响及其调控机制,有望为秦川牛分子育种工作提供新的理论依据。主要研究结果如下:1、circTTN的鉴定及对牛成肌细胞增殖和分化的影响circTTN来源于titin(TTN)基因,长度为675 nt。通过RNase R消化法、Sanger测序等实验证实了circTTN的真实性。通过RT-q PCR、Western Blot、流式细胞术、CCK-8、Ed U及免疫荧光染色实验技术证明过表达circTTN能够促进牛成肌细胞的增殖及分化,相反,干扰circTTN抑制了牛成肌细胞的增殖及分化。2、circTTN作为mi R-432的分子海绵,调控牛成肌细胞的增殖和分化RNA-FISH和核质分离实验结果显示circTTN主要存在于细胞质中,表明circTTN可能作为mi RNA的分子海绵调控牛成肌细胞的增殖及分化。利用生物信息学软件RNAhybrid预测发现circTTN与mi R-432有潜在的结合位点,双荧光素酶基因报告系统、RIP等实验结果显示circTTN可以与mi R-432相互作用。利用RT-q PCR、Western Blot、流式细胞术、CCK-8、Ed U及细胞免疫荧光实验,发现过表达circTTN可以逆转mi R-432对牛成肌细胞增殖与分化的抑制效应。3、circTTN通过吸附mi R-432调控IGF2/PI3K/AKT信号通路双荧光素酶基因报告系统、Western Blot等实验证明胰岛素生长因子2(IGF2)是mi R-432的直接靶基因。随后,利用RT-q PCR、Western Blot、流式细胞术等实验证明干扰IGF2能够抑制牛成肌细胞的增殖及分化,表明IGF2正向调控牛成肌细胞的增殖及分化。通过RT-q PCR、Western Blot实验检测过表达或干扰circTTN后IGF2/PI3K/AKT信号通路相关基因的表达,结果显示circTTN能够激活IGF2/PI3K/AKT信号通路。总之,circTTN通过吸附mi R-432进而激活IGF2/PI3K/AKT信号通路,从而促进牛成肌细胞的增殖及分化,为揭示肌生成复杂的分子调控机制提供有力的帮助,同时也为我国肉牛产业分子育种工作提供新的分子标记。