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目的本研究利用CRISPR/Cas9技术,进行基因编辑ADAM9序列,抑制其基因表达,旨在研究ADAM9在小鼠酒精性肝纤维化中的作用及调控的分子机制研究。方法（一）ADAM9-sg RNA3转染大鼠肝星状细胞HSC-T6:将本实验室前期筛选的有活性的ADAM9-sg RNA3质粒转染大鼠肝星状细胞HSC-T6,经过嘌呤酶素筛选,提取转染成功的细胞DNA进行PCR扩增、电泳、胶回收,然后进行测序,以此来验证有效sg RNA3蛋白。（二）体外实验:培养大鼠肝星状细胞HSC-T6,分为四组,正常HSC-T6对照组:不做任何处理;正常HSC-T6+酒精组:直接用酒精诱导培养;ADAM9-sg RNA3+酒精组:将有效sg RNA3进行稳定转染后给予酒精诱导培养;JNK抑制剂+酒精组:将JNK抑制剂SP600125和培养液混匀加入细胞温育24小时,再和酒精一起诱导细胞培养。免疫印迹检测相关因子表达:解整合素-金属蛋白酶ADAM9,c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路磷酸化蛋白p-c-Jun,平滑肌肌动蛋白α-SMA,增殖细胞核抗原PCNA,细胞凋亡相关蛋白Caspase-3。（三）体内实验:健康清洁的C57BL/6J雄性小鼠220只,随机分为4组:A组:正常对照组（10只）:采用对照Lieber-De Carli饲料TP4030C喂养;B组:生理盐水+酒精组（70只）:尾静脉注射生理盐水;C组:ADAM9-sg RNA3+酒精组（70只）:尾静脉注射有效ADAM9-sg RNA3质粒;D组:JNK抑制剂+alcohol组（70只）:尾静脉注射JNK抑制剂SP600125;B、C、D组分别采用Lieber-De Carli酒精饲料TP4030A喂养4周,之后联合腹腔注射5%CCl4橄榄油溶液2ml/kg,2次/周,直到第8周,建立小鼠酒精性肝纤维化动物模型,第8周集中处死,摘除眼球取血,分离小鼠血清检测AST、ALT这两个酶的数值;肝脏处理后,进行石蜡切片苏木精-伊红染色（HE染色）检测小鼠肝脏损伤情况;天狼星红染色检测小鼠肝脏纤维化程度;Hoechst33258细胞凋亡染色检测肝细胞的凋亡情况;免疫印迹检测相关因子表达:ADAM9,PCNA,血管内皮生长因子VEGF,细胞凋亡相关蛋白Bax,应激蛋白HSP70,代谢关键酶细胞色素P4502E1（CYP2E1）,肿瘤坏死因子TNF-α,α-SMA,p-c-Jun。结果DNA测序结果显示sg RNA3组基因序列与正常基因序列相比,差异大,蛋白免疫印迹结果显示:转染ADAM9-sg RNA3质粒的HSC-T6细胞ADAM9蛋白表达量较正常HSC-T6+酒精组细胞的表达量明显降低（P<0.01）,差异具有显著统计学意义,因此确定sg RNA3为有效向导RNA。体外实验:1.蛋白免疫印迹实验结果:与正常HSC-T6+酒精组相比,ADAM9-sg RNA3+酒精组和JNK抑制剂+酒精组细胞ADAM9,p-c-Jun,α-SMA,PCNA的蛋白表达量显著降低（P<0.01）,而Caspase-3的蛋白表达量显著上升（P<0.05或P<0.01）。体内实验:1.血清转氨酶变化情况:生理盐水+酒精组和ADAM9-sg RNA3+酒精组、JNK抑制剂+酒精组小鼠血清中AST、ALT水平较正常组明显升高（P<0.01或P<0.05）,其中ADAM9-sg RNA3+酒精组和JNK抑制剂+酒精组小鼠血清中AST、ALT水平显著低于生理盐水+酒精组（P<0.01或P<0.05）,JNK抑制剂+酒精组小鼠血清中AST、ALT水平与ADAM9-sg RNA3+酒精组相比降低更加明显（P<0.05）。2.苏木精-伊红染色情况:与正常组相比,生理盐水+酒精组和ADAM9-sg RNA3+酒精组以及JNK抑制剂+酒精组小鼠均出现显著肝损伤（P<0.01）;与生理盐水+酒精组小鼠相比,ADAM9-sg RNA3+酒精组和JNK抑制剂+酒精组小鼠肝细胞坏死显著降低（P<0.01）;与ADAM9-sg RNA3+酒精组相比,JNK抑制剂+酒精组小鼠肝细胞坏死降低更明显（P<0.05）。3.苦味酸-天狼星红染色结果:与正常组小鼠相比,其余三组小鼠都发生了显著的肝纤维化（P<0.01或P<0.05）,与生理盐水+酒精组小鼠相比,ADAM9-sg RNA3+酒精组和JNK抑制剂+酒精组小鼠肝纤维化减轻更加显著（P<0.01）;与ADAM9-sg RNA3+酒精组相比,JNK抑制剂+酒精组小鼠肝纤维化减轻更加明显（P<0.05）。4.Hoechst33528染色结果:与正常组小鼠相比,生理盐水+酒精组和ADAM9-sg RNA3+酒精组及JNK抑制剂+酒精组小鼠都发生了显著的肝细胞凋亡（P<0.01）;与生理盐水+酒精组小鼠相比,ADAM9-sg RNA3+酒精组和JNK抑制剂+酒精组小鼠肝细胞凋亡的数目有所减少（P<0.05或P<0.01）;与ADAM9-sg RNA3+酒精组小鼠相比,JNK抑制剂+酒精组小鼠肝细胞凋亡的数目更显著（P<0.05）。5.蛋白免疫印迹实验结果:与生理盐水+酒精组相比较,尾静脉注射ADAM9-sg RNA3+酒精组和尾静脉注射JNK抑制剂+酒精组肝内CYP2E1,Bax,TNF-α,ADAM9,α-SMA,p-c-Jun的蛋白表达量显著降低（P<0.05或P<0.01）;而VEGF,PCNA,HSP70的蛋白表达量显著升高（P<0.05或P<0.01）。结论在小鼠酒精性肝纤维化中,ADAM9起到促进肝纤维化的作用,ADAM9通过激活JNK信号通路促进小鼠酒精性肝纤维化。