第一部分静脉畸形组织中血管稳定性评价目的:非稳态血管与众多疾病(如脉管疾病、糖尿病引起的视网膜炎及肿瘤等)的发生发展,肿瘤的治疗效果及预后评价都有着密切的联系。本部分实验旨在对静脉畸形组织中异常扩张、管周细胞排列紊乱且分布不均的血管进行系统性分析,明确其所处病理状态。方法:利用免疫组织化学双染检测人正常皮肤及静脉畸形组织中血管内皮细胞标志物CD34及管周细胞标志物a-SMA的表达水平,评价管周细胞覆盖率;采用免疫组织荧光双染检测正常皮肤及静脉畸形组织中血管内皮细胞标志物CD34及管周细胞标志物a-SMA的表达水平;利用透射电子显微镜检测正常皮肤及静脉畸形组织中的血管超微结构;结合免疫组织化学及实时定量PCR技术检测正常皮肤及静脉畸形组织中血管點附分子的表达水平。结果:免疫组织化学双染数据显示:正常皮肤组织中血管内皮细胞紧密相连,管周覆有均勾分布的壁细胞(血管平滑肌细胞和周细胞),而静脉畸形组织中血管扩张明显、形态不规则,管周细胞分布不均且覆盖率(每nm长度血管周a-SMA阳性细胞数)明显低于正常皮肤组织。同时,透射电子显微镜检测结果显示:在静脉畸形中常可见“有窗”的血管内皮层,内皮细胞与基底膜间紧密接触减少,部分可见伸向管腔内侧的弯曲样结构,且基底膜不完整。此外,与正常皮肤组织比较,静脉畸形组织中血管勸附分子VE-cadherin和N-cadherin的蛋白及基因表达水平均显著下降。结论:静脉畸形中血管周细胞数目减少,内皮与基底膜结构异常,且點附分子表达下调。提示:静脉畸形中血管处于一种非稳定状态。第二部分Tie2/TCF-p平衡调控效应与静脉畸形非稳态血管的关系目的:静脉畸形是最常见的低流速型血管畸形,其主要病理学特点为静脉管腔不规则、伴有血栓及静脉石形成。因此,研究静脉畸形中非稳态血管的具体发生机制意义重大。已有研宄表明Tie2编码基因(TEK)突变导致的非配体依赖性的Tie2持续活化与静脉畸形的发病密切相关。本部分实验旨在研究静脉畸形中Tie2突变后的生物学效应、调控管周细胞招募及分化的细胞因子TGF-P表达变化及其与静脉畸形中非稳态血管的相关性。方法:利用免疫组织化学染色比较人正常皮肤及静脉畸形组织中Tie2的表达及憐酸化水平,并进行统计分析;利用连续切片、免疫组织化学双染、免疫组织焚光双染技术同时检测正常皮肤及静脉畸形组织中Tie2磷酸化水平与管周细胞覆盖率,并进行斯皮尔曼相关性分析;结合免疫组织化学染色及实时荧光定量PCR技术比较正常皮肤及静脉畸形组织中TGF-P的蛋白和基因表达水平,并进行统计分析;采用免疫荧光双染技术同时检测正常皮肤及静脉畸形组织中Tie2的表达及憐酸化水平、TGF-P的表达水平,并进行定量及斯皮尔曼相关性分析。原代培养人肪静脉内皮细胞及人静脉畸形内皮细胞,利用免疫焚光双染技术同时检测二者Tie2的表达及磷酸化水平、TGF-P的表达水平,并进行定量分析;利用Tie2激活剂Ang-1及外源性细胞因子TGF-P,通过免疫印迹及实时定量PCR技术探讨相关机制。结果:免疫组织化学及荧光染色数据显示:与正常皮肤相比,静脉畸形组织中Tie2的表达及憐酸化水平显著上调,且与管周细胞覆盖率呈显著负相关;TGF-P表达显著下调,与管周细胞覆盖率呈显著负相关;且Tie2憐酸化水平与TGF-P的表达呈显著负相关。体外细胞实验显示:与人肪静脉内皮细胞相比,人静脉畸形内皮细胞中Tie2的表达及隣酸化水平显著上调,TGF-P表达显著下调;以人肪静脉内皮细胞为研宄对象,免疫印迹及实时定量PCR数据显示:Tie2激活剂Ang-1可下调TGF-P的表达,而外源性细胞因子TGF-P可抑制Tie2的表达及憐酸化水平。结论:血管内皮细胞中可能存在Tie2/TGF-|3平衡调控效应,与静脉畸形中非稳态血管的形成密切相关,该发现可能为治疗血管异常相关疾病(血管畸形、肿瘤血管生成)提供新的思路。第三部分静脉畸形中潜在的治疗IE点-tgf-P/CC:N2信号通路目的:研宄显示静脉畸形存在血管非稳态及细胞外基质沉积改变。本部分实验旨在评估静脉畸形中调控细胞外基质分泌的基质细胞蛋白CCN家族的表达水平,TGF-P与CCN2信号分子在静脉畸形中的调控作用及其与静脉畸形中非稳态血管的相关性。方法:利用免疫组织化学染色比较人正常皮肤及静脉畸形组织中Tie2的表达及憐酸化水平、基质细胞蛋白CCN1-CCN6及TGF-P的表达、血小板衍生因子受体P(PDGFRP)憐酸化水平,并进行斯皮尔曼相关性及聚类分析;结合免疫组织焚光双染及实时定量PCR分析人静脉畸形组织中TGF-I3/CCN2信号通路的表达一致性;利用连续切片、免疫组织化学及免疫组织焚光技术检测CCN2与管周细胞覆盖的相关性;以人研静脉内皮细胞为研究对象,利用临床常用硬化剂博来霉素A5、外源性细胞因子TGF-P及CCN2,通过免疫印迹及实时定量PCR技术探讨相关机制。结果:免疫组织化学染色数据显示CCN2在正常皮肤组织中的成纤维细胞样细胞、血管内皮细胞及管周细胞呈强表达,而在静脉畸形组织中表达显著下调;相关性及聚类分析显示静脉畸形中CCN2和TGF-P表达呈显著正相关,且正常皮肤及静脉畸形组织中CCN2的表达水平与血管周a-SMA阳性细胞数密切相关。体外细胞实验发现:外源性细胞因子TGF-P及CCN2均可上调人挤静脉内皮细胞中CCN2及细胞外基质的表达水平,提示内皮细胞中同样存在TGF-P/CCN2信号通路。此外,博来霉素A5同样可上调内皮细胞TGF-P/CCN2及细胞外基质的表达水平。更有意义的是,博来霉素A5治疗后的静脉畸形组织中TGF-(3/CCN2和a-SMA表达均显著上调。结论:血管内皮细胞中存在TGF-P/CCN2信号通路,而静脉畸形组织中该通路的表达水平显著下调,可能与血管成熟过程中细胞外基质沉积减少、管周细胞覆盖异常导致的非稳态血管密切相关。TGF-P/CCN2信号通路有望成为静脉畸形治疗的祀点。第四部分新型平阳霉素PEG-PCL-PEG温敏性缓释凝胶的研制目的:制备可稳定释药、定位栓塞高流速血管的平阳霉素PEG-PCL-PEG温敏性缓释凝胶,并评价其缓释作用、栓塞效应及系统毒性。方法:采用开环聚合法,合成PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物,按30%质量分数充分溶解于双蒸水后,将平阳霉素包裹在其中,制备平阳霉素PEG-PCL-PEG温敏性凝胶。将该凝胶于体外环境和家兔耳中央动脉内做药物释放实验,观察平阳霉素的体内外缓释效果及动脉栓塞效应,并以Sprague-Dawley大鼠作为实验对象,分析其系统毒性及体内降解过程。结杲:平阳霉素PEG-PCL-PEG温敏性凝胶室温下为液态,注入体内后为固态凝胶。体外药物释放实验证明该凝胶具有显著地缓释效果,普通的平阳奪素注射液释药迅速,于90 min累积释药率达到100%;而平阳霍素PEG-PCL-PEG温敏性缓释凝胶可实现平缓持续性释药,于210 min累积释药率达到85.33%。通过肉眼观、H-E染色常规镜下观发现家兔耳中央动脉注射平阳霉素PEG-PCL-PEG温敏性凝胶2周后,给药处出现血管闭塞、血流中断,而普通平阳霉素注射液及空白PEG-PCL-PEG温敏性凝胶给药组未见明显变化。Sprague-Dawley大鼠体内降解及毒性实验证明该凝胶系统体内降解周期约14天,未见明显系统毒性。结论:平阳霉素PEG-PCL-PEG温敏性凝胶为一种安全有效的缓释系统,具有良好的生物相容性及可降解性。通过缓释平阳霉素和定位栓塞的作用,有效地将硬化治疗和介入治疗结合在一起,使高流速血管发生闭塞,为脉管畸形的治疗及恶性肿瘤的局部化疗提供了新的选择。