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第一部分条件培养基的制备及其对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)生物学功能的影响目的:体外培养MH7A,建立肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)诱导MH7A炎症损伤模型,制备来自MH7A的条件培养基。确定MH7A条件培养基诱导HUVEC的适宜浓度,并观察MH7A条件培养基对HUVEC生物学功能的影响及其产生作用的机制。方法:MH7A体外成功培养后,用浓度为2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL的TNF-α作用促进其增殖。CCK-8法检测TNF-α作用后MH7A的增殖活性以确定适宜的造模浓度。造模24 h后,提取MH7A培养液,并且从澄清度、无菌、pH值等方面对提取的培养液进行质量评价。HUVEC体外成功培养后,HUVEC经过不同浓度MH7A条件培养基诱导后,CCK-8法检测不同组HUVEC增殖活性以确定MH7A条件培养基诱导HUVEC的适宜浓度。采用条件培养基和普通培养基分别对实验组和对照组诱导24 h,采用CCK-8法、细胞划痕、细胞迁移法观察HUVEC增殖和迁移活性的变化,ELISA法检测HUVEC上清中血管紧张素-1(Angiotensin,Ang-1)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)和血管抑素(Angiostatin,AS)分泌量、蛋白质电泳法(Western-blot)法和RT-qPCR检测HUVEC中S1P-S1PR1及其下游RhoA-F-actin-NF-κB信号通路中关键蛋白S1PR1、RhoA、F-actin、NF-κB p65等的蛋白及mRNA表达量。结果:浓度为5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL的TNF-α均都能诱导MH7A增殖,10 ng/mL的TNF-α为造模的适宜浓度。提取的培养基为粉红色的澄清透明溶液,无菌、pH值为7.28±0.12,该溶液pH在多数细胞培养的适宜值(7.2-7.4)。CCK-8结果证明MH7A条件培养基原液、二倍及四倍稀释液均能诱导HUVEC增殖,在后续实验部分均采用MH7A条件培养基原液作为刺激物。经MH7A条件培养基诱导后,HUVEC增殖和迁移能力显著增加。HUVEC中促血管生成因子Ang-1、FGF分泌量升高,抑血管生成因子AS分泌水平下降,使促/抑血管生成因子动态平衡向促进血管新生方向移动。Western blot法检测S1PR1、RhoA、F-actin、NF-κB p65和NF-κB p-p65的蛋白表达量均上升。RT-qPCR检测HUVEC中S1PR1、RhoA、F-actin和NF-κB p65的mRNA表达量明显增加。结论:成功制备来自于MH7A的符合细胞培养基本要求的条件培养基。来自MH7A的条件培养基可成功诱导HUVEC增殖和迁移。MH7A条件培养基具有促进HUVEC血管新生的作用,其作用机制是通过活化S1P-S1PR1及其下游RhoA-F-actin-NF-κB信号通路实现的。第二部分栀子苷(Geniposide,GE)对MH7A条件培养基诱导的HUVEC生物学功能改变的治疗作用目的:探讨经GE给药后对条件培养基诱导的HUVEC生物学功能改变的治疗作用及其作用机制。方法:HUVEC经MH7A条件培养基诱导24 h,加入浓度为6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM的GE溶液作用24 h后,CCK-8法检测HUVEC的增殖活性以确定GE适宜给药浓度。采用细胞划痕、细胞迁移法观察给药后HUVEC迁移能力的变化,ELISA法检测HUVEC上清中Ang-1、FGF和AS分泌量、荧光染色法观察HUVEC中F-actin的形态和分布、Western-blot法和RT-q PCR检测MH7A条件培养基诱导的HUVEC中S1P-S1PR1及其下游Rho A-F-actin-NF-κB信号通路中关键蛋白S1PR1、Rho A、F-actin及NF-κB p65的蛋白表达量及RNA表达量。结果:经GE给药后,HUVEC的异常增殖反应得到抑制,且浓度为25μM、50μM、100μM的GE溶液作用较为显著。故以上三个剂量被用于之后的实验。且HUVEC增加的增殖活性和迁移能力均被GE显著抑制。HUVEC中失去动态平衡的促/抑血管生成因子得到改善,不同程度下调促血管生成因子Ang-1和FGF水平,上调抑血管生成因子AS水平。Western blot和RT-q PCR法检测S1PR1、Rho A、F-actin及NF-κB p65上升的蛋白和m RNA表达量均明显下调。结论:GE明显改善MH7A条件培养基对HUVEC的诱导作用,并且其作用机制是通过抑制S1P-S1PR1和下游RhoA-F-actin-NF-κB信号通路实现的,这些新的发现有助于我们进一步阐明GE在抑制类风湿关节炎血管新生和细胞骨架重组等方面的作用机制。