骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是一种来源于骨髓的非造血干细胞。研究证实BMSCs在体外培养的条件下，能分泌血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)及其他具有神经营养活性的细胞因子，经静脉或动脉移植的BMSCs能够通过血脑屏障到达缺血损伤区，通过细胞替代或分泌神经营养因子参与缺血脑损伤神经功能的修复。同时体外培养的BMSCs具有多向分化潜能、取材方便、体外培养扩增容易、遗传背景稳定、有内在组织相容性，免去了应用其它干细胞时筛除异抗原的必要，可自体移植，消除了异体移植的复杂性和免疫原性，并能迁移，都显示了其在基因治疗中可能成为理想的基因治疗运载细胞。因此，BMSCs不仅本身可参与缺血脑损伤神经功能的修复，同时还可作为脑缺血基因治疗的载体。　　 缺氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是一种氧敏感的转录激活因子，在低氧诱导下哺乳动物的各种组织细胞中广泛表达。HIF-1是由α和β亚基一个组成的异源二聚体。α亚基为HIF-1所特有亚基，既是HIF-1的调节亚基又是活性亚基，β亚基又称为芳香烃受体核移位体(ARNT)，在细胞内呈构成性表达，是HIF-1的构成亚基。HIF-1的生物活性主要决定于HIF-1α亚基的活性和表达。脑缺血缺氧后，缺血灶组织血流量减少，葡萄糖和氧供应不足，同时机体应激反应释放的一些物质如胰岛素样生长因子-1等因素诱导HIF-1在脑缺血灶组织中表达增加。HIF-1作为低氧反应的一种核转录调节因子，通过对其下游靶基因(VEGF、EPO、CXCR4等)的诱导表达，调控无氧代谢、血管生成、细胞增殖迁移分化等，在脑缺血损伤后的神经功能修复中起重要的作用。　　 本课题组前期实验将慢病毒载体介导突变型HIF-1α基因修饰BMSCs移植治疗大鼠脑缺血模型，结果发现脑缺血区域神经元存活数有所增加，同时神经功能恢复程度较损伤对照组有较大改善。但其具体机制不甚明了。本实验拟以神经元样细胞PC12细胞为体外缺血缺氧细胞模型，在缺氧条件下，将慢病毒载体介导突变型HIF-1α基因修饰的BMSCs(HIF-1α-BMSCs)与其进行培养，探讨HIF-1α-BMSCs对PC12细胞缺氧损伤的作用及其机制。　　 实验目的：　　 通过慢病毒介导突变型HIF-1α转染BMSCs，使BMSCs在常氧状态下稳定表达HIF-1α。并探讨突变型HIF-1α修饰的大鼠骨髓间充质干细胞(HIF-1α-BMSCs)对神经元样PC12细胞缺氧损伤的作用及其可能机制。　　 实验方法：　　 1、利用本实验室已成功构建的突变型HIF-1α慢病毒载体pLenti6/V5-HIF-1α-P402A-P564G-N803A-EGFP(简称pLenti6/V5-mHIF-1α-EGFP)与慢病毒包装系统共转染293FT细胞，收获并纯化病毒液。选择合适的MOI的滴度感染BMSCs，并通过Blasticidin筛选获得稳定转染HIF-1α基因的BMSCs(HIF-1α-BMSCs)。通过RT-PCR检测HIF-1α、VEGF在HIF-1α-BMSCs中mRNA水平的表达，Western blot检测常氧状态下HIF-1α在HIF-1α-BMSCs中蛋白水平的表达。　　 2、以神经元样PC12细胞为细胞缺氧模型，模拟体内建立体外缺血缺氧模型。实验共分为4组，分别为正常对照组、PC12缺氧组、PC12缺氧与BMSCs共培养组、PC12缺氧与HIF-1α-BMSCs共培养组。利用HE染色观察PC12细胞形态学改变，流式细胞术检测各组PC12细胞凋亡状况，RT-PCR检测PC12细胞凋亡相关基因survivin、caspase-3、bax、be1-2的mRNA表达，细胞免疫荧光检测survivin、caspase-3蛋白表达。　　 实验结果：　　 1、流式细胞仪检测MOI=100重组慢病毒感染BMSCs的效率约为79％～91％(48h)；RT-PCR结果显示，稳定转染HIF-1α后，在BMSCs中HIF-1αVEGF的mRNA表达均明显上调；Western blot结果显示，转染HIF-1α基因的BMSCs在常氧下可稳定表达HIF-1α蛋白。　　 2、MTT实验实验显示：PC12细胞缺氧0h，3h，6h，12h和24h的细胞活性分别为100％、90.3％、76.7％、45.1％、和23.3％，具有时间依赖性(图2-1)。缺血缺氧12h后，细胞活性下降至50％以下，确定12h为细胞模型缺血缺氧时间。　　 3、PC12细胞细胞形态学：缺氧12 h后，PC12细胞胞体肿胀混乱，胞内变性颗粒增多，形态改变明显；相当部分细胞已碎裂死亡。与BMSCs和HIF-1α-BMSCs共培养组，PC12胞体肿胀较轻，细胞死亡数较少，HIF-1α-MSC组保护作用更为明显。　　 4、PC12细胞凋亡率：与缺氧组相比，BMSCs和HIF-1α-BMSCs都能明显降低缺氧诱导的PC12细胞凋亡率，且HIF-1α-BMSCs作用更为明显。正常对照组、缺氧PC12细胞组、缺氧PC12细胞+BMSCs组及缺氧PC12细胞+HIF-1α-BMSCs组PC12细胞凋亡率分别为5.1±2.4％、53.8±3.3％、39.7±4.1％、26.6±1.9％。　　 5、凋亡相关基因检测：与正常组相比，缺氧组PC12细胞survivin mRNA表达未见明显改变(P＞0.05)，蛋白表达略有上调，但无统计学意义(P＞0.05)，caspase-3的mRNA和蛋白表达明显上调(p＜0.05)，bax/bcl-2 mRNA表达比值明显增加(p＜0.05)。与缺氧组相比，BMSCs及HIF-1α-BMSCs能上调PC12细胞survivin的表达(p＜0.05)，下调caspase-3的表达(p＜0.05)，bax/bcl-2 mRNA表达比值降低(p＜0.05)，且HIF-1α-BMSCs作用更为明显(p＜0.01)。　　 本文结论：　　 1.慢病毒载体介导突变型HIF-1α基因修饰的骨髓间质干细胞在常氧状态下能稳定表达HIF-1α，且使其下游基因VEGF表达上调。　　 2.慢病毒载体介导HIF-1α基因修饰的骨髓间质干细胞能降低PC12细胞缺氧损伤引起的凋亡率。　　 3、HIF-1α-BMSCs降低PC12细胞缺氧损伤引起的凋亡其机制可能是：BMSCs转染HIF-1α后，HIF-1α表达上调，从而促进其下游靶基因VEGF表达，并通过旁分泌作用于PC12细胞，使其抗凋亡基因survivin、bcl-2表达增加，促凋亡基因caspase-3、bax表达减少。