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胃癌在全球最常见的恶性肿瘤中排第四位,虽然发病率较前有所下降,但我国胃癌人数仍占全世界的42%,位居东亚地区常见癌症的首位。目前胃癌患者大多可选择化学治疗及行手术治疗,但其5年生存率仍低于50%,导致其死亡的主要原因之一是癌组织的浸润和转移。因此,研究胃癌的发生、发展和转移相关的具体机制,并对其进行早期预测和干预,对于制定治疗方案、改善患者预后是非常有益的。胃癌的发生、发展与肿瘤相关巨噬细胞的关系日益密切,而肿瘤相关巨噬细胞促进胃癌增殖、迁移及侵袭的机制目前研究较少,Wu H等报道了肿瘤相关巨噬细胞通过VEGF和VEGF-C的表达促进胃癌的血管新生及淋巴结转移。一些证据表明,趋化因子及其受体在调节肿瘤局部炎症及抑制免疫系统抗肿瘤反应中发挥一定作用,趋化因子配体5(CCL5/RANTES)属于CC类趋化因子家族,其受体有CCR1、CCR3和CCR5。CCL5主要表达于T淋巴细胞、巨噬细胞、血小板、滑膜成纤维细胞、肾小管上皮细胞和一定类型的肿瘤细胞,CCL5在肿瘤和炎性疾病中发挥重要作用。最近的研究发现乳腺癌病人中CCL5的表达与疾病进展直接相关,另外,在宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌和黑色素瘤患者的组织和血清中CCL5的表达与疾病进展具有相关性。而目前对CCL5的表达与胃癌的关系的研究尚未见报道。基于上述理论,我们进行了如下研究,首先我们对比了CCL5在胃癌组织和癌旁组织及胃癌患者和健康志愿者血清中的表达差异,并对组织中CCL5和肿瘤相关巨噬细胞的标志物CD68关系进行关联分析,同时对胃癌组织和患者血清中CCL5的表达与胃癌的病理因素及生物学行为之间的关系进行分析,结果发现位于胃癌肿瘤间质的TAMs高表达CCL5,而且其表达水平与胃癌的分期、预后及远处转移密切相关。因此我们还利用体外细胞实验对肿瘤相关巨噬细胞通过分泌CCL5对胃癌细胞发挥作用的具体机制进行了研究,为临床治疗胃癌提供了新的思路和靶点,对抗癌方案的设计具有非常重要的价值。具体研究内容和结果如下:第一部分ccl5在胃癌肿瘤相关巨噬细胞中的表达及其相关性研究目的:对胃癌中肿瘤相关巨噬细胞(tam)及其与ccl5表达的相关性进行研究。方法:选择临床病理资料完整的胃癌蜡块标本48例,取癌组织和癌旁组织,采用sp免疫组化法检测cd68和ccl5在胃癌组织及癌旁组织中的表达,并采用spearmann相关性统计方法对其相关性进行统计。结果:1cd68在胃癌组织的巨噬细胞中呈阳性表达,胞浆内含清晰的黄色或黄褐色颗粒者视为阳性。在癌旁组织中仅1例呈弱阳性表达,根据病理评分,行配对t检验,具有明显统计学差异(p<0.01),cd68的阳性表达程度与胃癌组织大小、浸润深度、分化程度、淋巴结转移情况、tnm分期情况、远处转移呈正相关性(p<0.05),与年龄、性别无相关性(p>0.05)。2ccl5在胃癌组织中呈阳性表达,胞浆内含清晰的黄色或黄褐色颗粒者视为阳性,癌旁组织中为阴性表达。根据病理评分,行配对t检验,具有明显统计学差异(p<0.01),ccl5的阳性表达程度与胃癌组织浸润深度、淋巴结转移情况、tnm分期情况及肿瘤分化程度呈正相关性(p<0.05),与年龄、性别无相关性(p>0.05)。3经spearmann相关分析,胃癌组织中ccl5与cd68的表达有显著的相关性,且呈正相关关系(r=0.759,p<0.01)。结论:cd68和ccl5可能对胃癌的发生、侵袭和转移起重要的促进作用,且ccl5与cd68的表达呈明显正相关,证明ccl5的分泌可能是tam促进胃癌侵袭转移的重要原因之一。第二部分ccl5在胃癌患者血清中的表达及临床意义目的:检测胃癌患者血清中的ccl5表达并探讨其临床意义。方法:抽取新诊断胃癌患者50例(均未行手术及放化疗)及健康志愿者16例的血清标本,采用elisa检测ccl5在胃癌患者及健康志愿者血清中的表达,比较两者的表达差异,研究ccl5的表达水平与胃癌的病理因素及生物学行为之间的关系。结果:与对照组相比,胃癌患者血清的ccl5表达水平明显高于对照组(p<0.001),ccl5的表达水平在患者的年龄及性别比较中无明显差别。反之,肿瘤越大、浸润越深、分化程度越低、伴淋巴结及远处转移的、瘤栓形成、病理分期晚的患者的血清ccl5的表达水平较肿瘤小的、浸润浅的、分化程度高的、无淋巴结及远处转移的、无瘤栓形成的、病理分期早的患者的血清ccl5的表达水平偏高,具有统计学差异(p<0.01)。结论:ccl5在胃癌患者血清中高表达,血清中ccl5的表达水平与胃癌组织浸润深度、淋巴结转移情况、tnm分期情况及肿瘤分化程度均具有相关性,与患者的性别及年龄无相关性。第三部分肿瘤相关巨噬细胞通过高表达ccl5对胃癌细胞生物学行为的影响目的:观察肿瘤相关巨噬细胞(tumorassociated-macrophagestam)分泌的ccl5对胃癌细胞生物学行为的影响,探讨tams在胃癌侵袭转移中的作用及机制。方法:将人单核细胞株thp-1体外经il-4诱导为类m2型巨噬细胞,并与胃癌细胞株ags共培养形成胃癌微环境,体外细胞实验验证tams通过分泌ccl5促进胃癌细胞的增殖、侵袭和转移,rt-pcr检测趋化因子及其受体的表达情况,westernblot检测stat3信号及下游目的蛋白的表达变化。结果:1mts细胞增殖实验显示,培养5天后,用il-4诱导的巨噬细胞上清液培养的胃癌细胞增殖率为(397.57±28.82)%,高于与thp-1上清共培养组(385.95±32.56)%和未共培养的胃癌细胞组(320.49±7.62)%,(p<0.05),具有统计学意义。用il-4诱导的巨噬细胞上清液培养的胃癌细胞数量高于与thp-1上清共培养组和单纯胃癌细胞组,具有统计学意义(p<0.05)。2与未共培养的胃癌细胞组相比,与thp-1上清共培养组和与thp-1上清共培养经il-4诱导组穿出小室的细胞数明显增多(p<0.01),经il-4诱导组胃癌细胞迁移能力增强,穿出小室的细胞数多于用thp-1上清共培养组(p<0.01),具有统计学意义。3与未共培养的胃癌细胞组相比,与thp-1共培养组和与thp-1共培养经il-4诱导组的胃癌细胞的克隆形成数明显增多(p<0.01),分别为38.00±7.21/高倍视野和58.33±3.79/高倍视野,与THP-1共培养经IL-4诱导组的胃癌细胞的克隆形成数较与THP-1共培养组明显增多(P<0.01),具有统计学意义。4 THP-1组、THP-1与AGS共培养组、THP-1与AGS共培养经IL-4诱导组THP-1细胞中CCL2、CCL4、CCL17、CCL22的mRNA相对表达量比较无明显差异(P>0.05),而CCL5、MMP2、MMP9mRNA的相对表达量明显增多(P<0.01),CCL5mRNA的表达量较MMP2和MMP9明显增多(P<0.01)。CCL5、MMP2、MMP9mRNA的相对表达量在THP-1与AGS共培养组分别为2.32±0.94、1.59±0.34、1.46±0.13,THP-1与AGS共培养经IL-4诱导组细胞中的表达分别为3.98±0.34、2 2.4±0.26、2.07±0.45均高于THP-1组(P<0.01),且THP-1与AGS共培养经IL-4诱导组中表达最多(P<0.01),具有统计学意义。5与未共培养的胃癌细胞组相比,用THP-1上清共培养组和用THP-1上清共培养经IL-4诱导组胃癌细胞表面CCL5受体CCR5mRNA的相对表达量明显增多(P<0.01),以用THP-1上清共培养经IL-4诱导组的表达量最多(P<0.01),具有统计学意义。6在AGS中加入不同浓度的CCL5(0μM/ml、10μM/ml、50μM/ml),随着CCL5浓度的增加发生迁移的细胞数量也随之增加,以CCL5(50μM/ml)浓度时发生迁移的细胞数最多,达28.33±5.13/高倍视野(P<0.01),具有统计学意义。7与THP-1来源的巨噬细胞共培养后Stat3和p-Stat3(p-S727和p-Y705)的表达明显增加,高于胃癌细胞组和与THP-1共培养组(P<0.01),p-Stat3(p-S727和p-Y705)的变化趋势与Stat3呈现一致性(P>0.05)。结论:与THP-1来源的巨噬细胞上清共培养后胃癌细胞增殖和克隆形成能力增强,而且共培养后THP-1细胞中CCL5mRNA的表达量最高,而AGS表面CCR5mRNA相对表达量最高。随着CCL5浓度的增加发生迁移的胃癌细胞数量也随之增加。共培养后AGS中Stat3信号及其目的蛋白表达增加。